2/4. Как разработать наиболее эффективный способ выделения ДНК для домашних условий?

При выделении из образцов окружающей среды или из культуральной среды

многие вещества (как высоко-, так и низкомолекулярные) могут либо разрушать ДНК (нуклеазы), либо связывать её, либо мешать её определению (например, РНК и низкомолекулярные нуклеотиды при фотометрическом анализе или ингибиторы амплификации при ПЦР-анализе)

Различные органеллы, куски мембран, клеточный дебрис из гомогената после разрушения (лизиса) клеток - обычно используют центрифугирование

разрушить или удалить

разрушить и удалить продукты деградации

удалить

адаптировать существующие лабораторные протоколы к использованием других реагентов и материаловразрабатывать новые лабораторные протоколыоценивать эффективность выделения целевого продукта из биологического материала

Какие компоненты среды для выделения являются необходимыми для выделения ДНК, а какие лишь могут повысить эффективность или удобство выделения?Какие группы детергентов (ПАВ) существуют и какие особенности их свойств могут повлиять на эффективность выделения ДНК?Что можно использовать из общедоступных веществ и материалов для селективного разрушения белков при сохранении структуры ДНК?Какие факторы влияют на эффективность выделения ДНК методами с использованием общедоступных реагентов?

Подготовительная часть (преподаватель + лаборант): подготовка необходимых материалов и оборудования.Подготовительная часть (лаборант): выращивание культуры бактерий Lactobacillus plantarum, Propionibacterium freudenreichii, Streptococcus thermophilus и(или) Lactococcus lactis subsp. diacetilactis. Данные культуры выбраны, поскольку они легко доступны в качестве моновидовых заквасок и легко растут на молоке или молочных средах. Могут быть заменены на любые другие непатогенные бактерии.Основная часть (студенты на занятии): работа ведется в подгруппах, сформированных в конце занятия 1. Протокол выполнения разрабатывается студентами в качества внеаудиторной самостоятельной работы между занятиями 1 и 2. По усмотрению преподавателя каждым методом может выделяться ДНК из одного или нескольких бактериальных культур.Важно! Поскольку студенты работают с разными условиями экспериментов преподавателю следует обеспечить студентам возможность ознакомиться с результатами друг друга. Делать это в ходе выполнения эксперимента или во время заключительного мини-коллоквиума занятия - выбор преподавателя.Также важно! Образцы, полученные в ходе работы, используются далее в ходе лабораторной работы 3/1.

Протокол выполнения опытаВажно! студенты сами разрабатывают протокол и приносят общедоступные материалы для его осуществления на занятие. Параллельно с собственным протоколом студенты всех подгрупп проводят выделение ДНК одним из стандартных методов с использованием готовых наборов реагентов (например, Biosilica GBD-50 (протокол: http://biosilica.ru/wp-content/uploads/2015/12/GBD-50.pdf), или любой другой по усмотрению преподавателя).Обязательные компоненты протоколаОсаждение клеток из культуры с использованием одной из самодельных центрифуг, протестированных в работе 2/2.Разрушение клеток в присутствии детергента.Использование щелочной среды для разрушения РНК.Использование протеиназ для разрушения белков.Осаждение ДНК с помощью органического растворителя.Перерастворение осажденной ДНК в буферном растворе для хранения.После получения финального препарата ДНК в буферном растворе проводится определение содержания ДНК подходящим чувствительным методом (например, фотометрически при длине волны 260 нм или флюориметрически на приборе Qubit 4 (Thermo Fischer) или MaxLife (МВМ-Диагностик, Россия).Затем финальный препарат замораживается до использования на занятии 3 (лабораторная работа 3/1).

Выполняется внеаудиторно. Загружается дистанционно для оценки преподавателем с использованием выбранного формата интерактивного общения (LMS, облачное файлохранилище, социальные сети, онлайн-сервисы организации совместной работы и т.д.).

В свободной форме, отражающей:цель эксперимента,протокол выполнения работы,обоснование использования тех или иных заменителей лабораторных реагентов;расчеты используемых концентраций общедоступных веществ и материалов;пошаговые иллюстрации выполнения протокола в виде фото- или видеофайлов;результаты определения содержания ДНК в финальном препарате и расчет достигнутого выхода ДНК из бактериальной массы;сравнить результаты, полученные по собственному протоколу, с результатами выделения фабричным набором реактивов)общий вывод с указанием, достигнута ли цель эксперимента.

Антонова О.С., Корнева Н.А., Белов Ю.В., Курочкин В.Е. Эффективные методы выделения нуклеиновых кислот для проведения анализов в молекулярной биологии. Научное приборостроение. 2010: 20(1): 3-9

Для бактерий хорошим прототипом является метод щелочного лизиса с детергентами

Нарушает стабильность клеточной мембраны, способствуя разрушению клетки

поддерживают величину рН примерно постоянной в ходе выделения - например, сочетание нужных пропорций уксусной кислоты (столового уксуса) и NaOH (например, из средства для очистки канализационных труб) или сочетание натрия карбоната (кальцинированная сода) и бикарбоната (питьевая или чайная сода)

создают нужные ионную силу и осмотическое давление, модифицируют растворимость ДНК (соли магния, например) или балластных веществ

при рН > 9 в среде быстро разрушаются примеси РНК, кроме того, щелочные условия улучшают эффективность разрушения клеточной стенки