TALEN

Все началось в 1972 году в лаборатории Пола Берга, когда ученые объединили геном кишечной палочки с генами бактериофага и вируса SV40.

В 1996 году было впервые показано, что белковый домен типа «цинковые пальцы», соединенный с FokI-эндонуклеазным доменом, действуеткак сайт-специфическая нуклеаза, разрезая ДНК in vitro в строго определенных участках

Transcription Activator-Like Effector Nucleases (эффекторные нуклеазы, подобные активаторамтранскрипции)Такая системы, активно применяемая для различных манипуляций с геномами, позволяет решать сложные задачи,включая получение мутантных и трансгенных растений и животных, создание и исследование моделей заболеваний на основе культивируемых плюрипотентных клеток человека.Кроме того, химерные белки на основе ДНК-связывающих доменов TALE используют в экспериментах по регуляции транскрипции генов,для изучения эпигеномов и поведения хромосомных локусов в клеточном цикле.

Впервые способностьэтих белков связываться с ДНК была описана в 2007 году, а всего через год двумя группами ученых был расшифрован код узнавания целевой последовательности ДНК белками TALE

ДНК-связывающий домен состоит из мономеров,каждый из которых связывается с одним нуклеотидом в целевой нуклеотидной последовательности.Мономеры представляют собой тандемные повторы из 34 аминокислотных остатков, из которых два, расположенные в позициях 12 и 13, высоко вариабельные (Repeat Variable Diresidue, RVD), и именно они отвечают за узнавание определенного нуклеотида.

В большинстве работ используют мономеры, содержащие RVDAsn и Ile (NI), Asn и Gly (NG), два Asn (NN), His и Asp(HD)

С этой целью последовательность, кодирующая ДНК-связывающийдомен TALE, встроили в плазмидный вектор, использованный ранее при создании ZFN

Нуклеаза делает в сайте-мишени двухцепочечные разрывы, которые репарируются в клетке по одному из двух возможных механизмов

это событие происходит в клетке довольно редко, но использование TALENs позволяет повысить вероятность прохождения гомологичной рекомбинации на несколько порядков.

карочиря ище с муковисцидозом

Редактирование геномов растений с помощью системы TALEN к настоящему времени проведено на четырех модельных объектах. Примером растения, которое приобрело новые свойства в результате редактирования генома системой TALEN, служит рис, устойчивый к патогену Xanthomonas oryzaepv.

История разработки этой системы связана с изучением бактерий рода Xanthomonas. Эти бактерии являются патогенами таких культурных растений,как рис, перец, томат, они наносят экономически значимый вред сельскому хозяйству, что стало причиной их тщательного изучения.

1. различия в эффективности связывания RVD и специфических нуклеотидов2. из-за вырожденности кода связывания нуклеотидов3. возможна димеризация доменов FokI двух нуклеаз с одинаковыми ДНК-связывающимидоменами4. размер спейсерной ДНК между сайтами узнавания нуклеаз не фиксирован

Для направленной активации экспрессии генов используются конструкции, содержащие ДНК-связывающий домен TALE и синтетический доменVP64 – TALE-TF. Попадая в ядро, химерный белок связывается с целевой нуклеотидной последовательностью, домен VP64 привлекает эндогенные активаторы экспрессии генов. При этом значимо увеличивается экспрессия целевого гена, что обычно подтверждают с помощью ПЦР в реальном времени. Возможна также активация не-кодирующих генов, например генов микроРНК .Подавление экспрессии целевого гена может достигаться при использовании химерных белков, содержащих домены KRAB или SRDX .

Экспансия тринуклеотидных повторов GAA в этом гене приводит к развитию атаксии Фридрейха, при этом структура белка не меняется, однако снижается его экспрессия.Показано, что с помощью TALE-TF можно повыситьэкспрессию гена FXN в фибробластах человека, несмотря на увеличенное число тринуклеотидных повторов