Tecnologías de secuenciación
Análisis de secuencias genómicas de organismos.
Primera generación
Método de terminación de cadena: Método de Sanger.
Usar DNA como plantilla para secuenciar.
Primer
Permite la elongación de la nueva cadena.
dNTP
Posee un grupo OH
La unión a otro dNTP para la elongación de la nueva cadena.
ddNTP (modificado)
Posee un H
Terminación de la elongación de la nueva cadena.
Fluoróforo
Da un color determinando la terminación de la cadena.
Láser en un capilar.
Electroforesis capilar
Migración de moléculas de una muestra de acuerdo a su tamaño
DNA polimerasa
Incorpora dNTP a la nueva cadena.
Limitaciones
Cantidad de reads baja con respecto a otros equipos.
Baja calidad de primeras 10- 40 bases
El tiempo es extenso
Costo
El tamaño de bases de datos es pequeña
Resultados
Electroforesis
Cromatograma
Ventajas
La lectura de ADN es larga con respecto a otros equipos.
Preparación
Fragmentación del genoma.
Clonación de fragmentos en un vector.
Secuenciación con ddNTP
Método de degradación química: secuenciación Maxam-Gilbert
Tratamiento químico
Roturas en 1 o 2 bases de nucleótidos.
Cuatro reacciones.
NGS: Secuenciación de nueva generación.
Sistemas que pueden generar información
Secuenciar de forma masiva y en paralelo billones de reads.
Ventajas
Bajo costo
Eficiente
Las lecturas son más largas.
No se necesita realizar electroforesis
El proceso es más rápido.
Preparación.
Fragmentación del genoma.
Unión de adaptadores.
Formación de librerías.
Amplificación por PCR
"Bridge PCR"
Unión de un primer a una secuencia de interés.
Emulsion PCR.
Emulsión en un tubo con
Polimerasa
Oligonucleótidos
Plataformas de secuenciación.
"Roche/454 Sequencing."
Pirosecuenciación.
Placas de picotitulación
Dos tipos de microperlas
Luciferasa.
Sulfurilasa.
Nucleótidos específicos
La secuencia original por acción de la polimerasa
reacciona con
Fosfato inforgánico
Resultados
Pirograma.
"Ion torrent technology."
Se puede hacer de dos formas:
Emulsión PCR.
Placa picotituladora que poseen microperlas.
Se le añaden nucleótidos a la cadena naciente.
Iones de hidrógeno.
Cambios en el pH de la dilución
Detectado por un micropontenciómetro.
Adición de T'S en los pocillos.
Coindicen con la secuencia original.
Dos iones de hidrógeno.
Cambio mayor en el pH de la dilución
Traducido a Base-cooling.
"Sequencing by ligation."
Secuenciamiento de templates.
Ligasas.
Liga la sonda (marcada con fluoróforo) con el template y primer universal.
Alineamiento.
Se repite x 10 ciclos
La eliminación e incoporporación sucesiva
Fluoróforos.
"Cyclic reversible termination."
Utiliza bases del Método de Sanger.
Incorporación de nucleótidos marcados.
Templates unidos a adaptadores y primers universales.
Inicia la inserción de nucleótidos (cada un con diferente color)
Se realiza lavado.
Obtención de nucleótidos que se incorporan a la cadena naciente.
Se repite
La eliminación e incorporación sucesiva
Fluoróforos.
Nucleótidos de terminación virtuales.
Nucleósido modificado
Estar unido a nucleótido de cadena naciente.
Inhibición de elongación de la cadena.
No estar unido a nucleótido de cadena naciente.
Elongación de la cadena.
"SMRT single Molecule Real Time."
Hay dos tipos:
"Short Reads."
Ensable de fragmentos.
Silico.
"Long Reads."
"Pacific Biosciences"
Usa 4 fluoróforos unidos a nucleótidos.
El grupo fosfato es cortado
Fluorescencia.
"Real Time Sequencing: Oxford Nanopore Technologies."
El gradiente de corriente
Nucleótidos llamados "K-meros"
Illumina.
Proceso de secuenciación.
"Chips" de vidrio que poseen 8 canales.
Tiene adherido primers.
Hibridación con una molécula
Extensión de la cadena naciente o complementaria.
Forma un puente o "bridge" a un primer adyacente.
Se une la polimerasa sintetizando una nueva cadena
Se repite el anterior proceso exponencialmente.
Un Cluster.
Subtopic
Se deshacen y se inhibe la secuenciación por
Cambios de temperatura.
Se bloquean los extremos 3'
Fluoróforos.
Emite luz por láser.
Separación y eliminación de la cadena original.
Polimerasa
Extiende la cadena con
Resultados.
4 fotos x ciclo del chip
Características.
Los reads son de una longitud fija.
El error de sustitución es el error más común.
La tasa no es uniforme y puede incrementar.
Es frecuente en secuencias con alto contenido de GC.
Son raros los errores por inserción o deleción.
Aplicaciones.
Alinear secuencias a secuencias que no se conozcan en "Sequencing de novo"
Medición de la variación genética de un organismo que ya se conoce,
Analizar resultados de transcriptómica
Analizar cambios epigenómicos.
Analizar cambios en los mecanismos reguladores del genoma.
Metagenómica para estudiar ecología microbiana.
ATP
Luciferasa
Luz
Detectada por sensor en la placa.