Inmuno-Analisis
¿Que es ?
-Técnica de laboratorio -Detecta y cuantifica sustancias específicas
Funfamentos
-Basado en reacciones inmunológicas -Alta especificidad de unión entre antígeno y anticuerpo
Sustancias detectadas
-Proteínas
-Hormonas
-Anticuerpos
1.3 Tipos de reacciones inmunologicas
Interacción Primaria
- Directa entre Antígeno y Anticuerpo
Interacción Secundaria
- Precipitación
- Floculación
- Aglutinación
- Fijación del complemento
Interacción Terciaria
- Activación del sistema del complemento
- Opsonización
- Fagocitosis
- Quimiotaxis
1.4 Principios generales de los inmunoanalisis
Técnicas
- Detectar y cuantificar Antígenos y Anticuerpos
- Reactivos marcados o sin marcar
Clasificación
- Tipo I: Exceso de Anticuerpo
- Observación de distribución entre complejo y parte residual
-Tipo II: Exceso de Analizado
- Observación de distribución del analizado
1.5. Métodos de inmunoanálisis: Clasificación
Inmunoanálisis de partículas
Pruebas de aglutinación de partículas
- Directa
- Aglomeración de células/suspensión de partículas insolubles
Indirecta o pasiva
- Aglutinación de células/partículas inertes recubiertas de antígenos o anticuerpos solubles
Prueba de Anti globulina (Coombs)
- Detectar anticuerpos incompletos
1.6 Enzimoinmunoanalisis
Definicion y uso
Descrito en 1971 por Avrameas
Nombres alternativos: ELISA, EIA, EMIT
Usa enzimas como marcadores para detectar antígenos o anticuerpos
Clasificación
-Según el reactivo a determinar (antígeno o anticuerpo)
- Según el reactivo marcado
- Naturaleza competitiva o no del análisis
- Método de separación de reactivos unidos o libres
- Tipos: Heterogéneo y Homogéneo
Tipos
1.6.2 EIA Homogeneo
- No requiere separación de componentes libres y marcados
- La reacción antígeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima
Variantes
Antígeno o analizado marcado enzimáticamente
- EMIT (técnica de inmunoanálisis enzimático multiplicado)
- Determinación de fármacos y hormonas
Sustrato enzimático marcado
- Inmunoanálisis de fluorescencia (SLFIA)
- Determinación de fármacos, haptenos, IgG e IgM
Otros EIA Homogéneos
- Análisis con grupo prostético marcado
- Análisis con fosfolipasa C
- Inmunoanálisis con refuerzo enzimático
- Análisis con conjugado de avidina-antígeno y biotina
- Análisis con donador enzimático clonado
- Inmunoanálisis con modulador enzimático
- Inmunoanálisis de canalización enzimática
- Enzimoinmunoanálisis con liposomas
Co-factor enzimático marcado
- Unión covalente de antígeno/producto con co-factor enzimático
- Uso de NAD como co-factor
Enzimas más usadas
- Lisozima
- Malato-deshidrogenasa
- Glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
- Fosfolipasa-C
- β-D-Galactosidasa
1.7.0 Inmunoanálisis por fluorescencia (FIA)
- Primer uso por Coons (1941)
Fluoróforos: compuestos orgánicos con estructura en anillo
Marcador estándar: FITC
Clasificación
Heterogéneos
- Método indirecto (IFI)
- Método competitivo
- Método de sándwich
- Método fluoroinmunométrico
- PCFIA: Análisis inmunofluorométrico por partición radial
Homogéneos
- Aumento/disminución de la fluorescencia de haptenos
- Inmunoanálisis por transferencia de excitación de la fluorescencia
- Inmunoanálisis de protección de la fluorescencia
- Inmunoanálisis de fluorescencia con sustrato marcado (SLFIA)
1.8 Radioinmunoanálisis (RIA)
- Creado por Berson y Yallow (1956)
Clasificación
Competitivo
-Detección de Hormonas
-Detección de Drogas en el Suero
-Detección de Anticuerpos Específicos
-Detección de Agentes Tumorales
No competitivo
(IRMA)
- Empleo de dos anticuerpos
Características
- Mayor sensibilidad y exactitud
- Uso en determinación de hormonas, péptidos, monitoreo de drogas
1.9 Inmunoanálisis de precipitación
- Análisis de precipitinas
Metodos
Inmuno-precipitación en geles
- Inmunodifusión radial (IDR)
- Técnica de electroinmunodifusión de dimensión simple
Otros métodos inmunoelectroforéticos
- Inmunoelectroforesis
Otros métodos de Inmuno precipitación
- Inmunoanálisis nefelométricos
- Turbidimetría
- Nefelometría
1.10. Western Blot (WB)
- Técnica para detectar proteínas
Etapas
extracción, electroforesis, transferencia, bloqueo, detección
Tipos de WB
Far-Western blotting
Double blotting
1.11 Citometría de flujo
Determinación de estirpe celular, etapa de maduración, estado de activación
- Uso de sondas fluorescentes y fluorímetro con láser
1.1Anticuerpo
- Molécula bi-funcional
- Se une a Antígenos mediante la Región Hiper-variable
- Se une a células por la región Fc
Clasificación
- Origen
- Especificidad frente al huésped
- Reacciones inmunológicas
1.2 Cinetica de reacciones
-Estudio de la velocidad de las reacciones inmunológicas
-Análisis de factores que afectan la tasa de estas reacciones
Factores que Afectan la Cinética
Concentración de Reactantes:
-Antígeno
-Anticuerpo
Temperatura:
Afecta la velocidad de las reacciones enzimáticas
Presencia de Catalizadores:
-Enzimas que pueden acelerar la reacción
1.6.1 EIA Heterogeneo
La reacción antígeno-anticuerpo no modifica la actividad del marcador enzimático
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Competitivo
- Antígeno marcado por una enzima - Conjugados de enzima-anticuerpo
Pasos
1. Anticuerpo específico se une a una matriz de fase sólida
2. Lavado para eliminar anticuerpos no unidos
3. Incubación con antígeno marcado enzimáticamente y antígeno estándar/prueba
4. Lavado con tampón
5. Incubación de la fase sólida con solución de sustrato enzimático
6. Medición espectrofotométrica del producto de reacción
No competitivo
Tipo “Sándwich
- Anticuerpo inmovilizado en fase sólida
- Incubación con antígeno estándar o de prueba
- Lavado y adición de anticuerpo marcado enzimáticamente
- Incubación con solución de sustrato enzimático
- Medición del producto enzimático
Indirecto
- Uso de antígenos inmovilizados
- Reacción con muestra de anticuerpos
- Lavado y reacción con anticuerpo marcado enzimáticamente
- Medición de anticuerpos específicos contra virus, IgM e IgG
Enzimas más usadas
- Peroxidasa de rábano
- Fosfatasa alcalina
- β-D-Galactosidasa
- Glucosa oxidasa
- Glucoamilasa
- Anhidrasa carbónica
- Acetilcolinesterasa
- Catalasa