5/2. Можно ли покрасить бактерии по Граму реактивами только из магазина и аптеки?

удалить

многие вещества (как высоко-, так и низкомолекулярные) могут либо разрушать ДНК (нуклеазы), либо связывать её, либо мешать её определению (например, РНК и низкомолекулярные нуклеотиды при фотометрическом анализе или ингибиторы амплификации при ПЦР-анализе)

адаптировать существующие лабораторные протоколы к использованием других реагентов и материаловразрабатывать новые лабораторные протоколыоценивать эффективность выделения целевого продукта из биологического материала

Какие общие свойства у первичных красителей для окраски по Граму?Зачем используется дополнительный краситель в окраске по Граму?Можно ли найти общие свойства у вторичных красителей для окраски по Граму?

Подготовительная часть (преподаватель + лаборант): подготовка необходимых материалов и оборудования.Подготовительная часть (лаборант): выращивание культур грамположительных (например, Bacillus subtilis, Lactobacillus sp., Streptococcus thermophilus, Lactococcus sp.) и грамотрицательных (например, Escherichia coli) бактерий; приготовление смешанной суспензии грамположительных и грамотрицательных бактерий.Основная часть (студенты на занятии): работа ведется в парах, полученная у преподавателя суспензия бактерий окрашивается реагенами из коммерческого набора и самостоятельно приготовленными реагентами.

Протокол выполнения опытаПриготовление раствора бриллиантового зеленого10 мл аптечного 1% спиртового раствора бриллиантового зеленого смешать с 10 мл воды.Приготовление раствора Люголя для микроскопии 20 мл аптечного раствора Люголя смешать с 83 мл воды.Приготовление йодного спиртаК 98 мл этанола добавить 2 мл 5% аптечной настойки йода и 0,46 г йодида калия; тщательно размешать.Приготовление раствора вторичного красителяПриготовить 10 мл водного раствора тартразина (2%, пищевой краситель), сафранина (0,25%, текстильный краситель) или кармуазина (0,25%, пищевой краситель).Обязательные компоненты протоколаОсаждение клеток из культуры с использованием одной из самодельных центрифуг, протестированных в работе 2/2.Разрушение клеток в присутствии детергента.Окрашивание по Граму с использованием коммерческого набора реактивовПровести окрашивание мазка суспензии бактерий в соответствии с инструкцией по применению набора реактивов для окрашивания по Граму (протокол может отличаться в зависимости от производителя наборов).Окрашивание по Граму с использованием самостоятельно приготовленных реактивов (2 варианта в зависимости от способа обесцвечивания)Приготовить мазки суспензии бактерий на двух предметных стеклах, для чего равномерно распределить суспензию на выбранных участках стекол и высушить;Зафиксировать высушенные мазки термическим способом, для чего предметное стекло взять пинцетом и плавным движением провесть трижды над верхней части пламени горелки или спиртовки (время нагревания не должно превышать 2-3 с);Нанести на мазки раствор бриллиантового зеленого на 1 мин;Смыть краситель со стекол проточной водой;Нанести на мазки раствор Люголя на 1 мин;Смыть раствор Люголя водой;Нанести на один мазок этанол на 30-60 с, на другой - йодный спирт на 1 мин;Смыть обесцвечивающие растворы водой;Нанести на мазки раствор вторичного красителя на 1 мин;Смыть краситель и микроскопировать мазки.

Выполняется внеаудиторно. Загружается дистанционно для оценки преподавателем с использованием выбранного формата интерактивного общения (LMS, облачное файлохранилище, социальные сети, онлайн-сервисы организации совместной работы и т.д.).

В свободной форме, отражающей:цель эксперимента,протоколы выполнения работы,пошаговые иллюстрации приготовления самодельных растворов для окрашивания по Граму;пошаговые иллюстрации окрашивания по Граму с использованием коммерческого набора и самодельных растворов;сравнение результатов окрашивания одного и того же препарата различными способами;общий вывод с указанием, достигнута ли цель эксперимента.В качестве иллюстративного материала можно использовать фото- или видеофайлы

Alturkistani H.A., Tashkandi F.M., Mohammedsaleh Z.M. Histological Stains: A Literature Review and Case Study. Glob. J. Health Sci. 2015; 8(3): 72-79. doi: 10.5539/gjhs.v8n3p72

Silhavy T.J., Kahne D., Walker S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2010; 2(5): a000414. doi: 10.1101/cshperspect.a000414

Когда протокол окрашивания клеток содержит несколько этапов формирования окраски, а получающаяся окраска будет минимум двухцветной - такие окраски называют сложными

Исследуемый материал (жидкость или суспензия) равномерно распределяют на определенном участке предметного стекла и высушивают. После полного высыхания мазка его фиксируют (стадия 2)

Используемый на этом этапе краситель в отечественной литературе чаще всего называется основны́м, при этом по химической природе он должен быть оснóвным - чтобы избежать двусмысленности из-за игры слов, я использую термин «первичный краситель». Аналогичный термин широко применяется в англоязычной литературе (primary dye)

Обычно фиксируют раствором Люголя (в микробиологии соотношение йода, йодида калия и воды 1:2:100) - не путайте его с аптечным раствором Люголя (те же компоненты в соотношении 1:2:17). Также может использоваться раствор Грама (соотношение йода, йодида калия и воды 1:2:300)

проводят короткой обработкой органическими растворителями - этанолом, метанолом, ацетономдля улучшения результатов (во избежание переобесцвечивания) можно использовать йодный спирт (0,1% йода и 0,5% йодида калия в этаноле)

Обычно используются анионные красители

наиболее распространенный и более быстрый способ фиксации, по сравнению с химической - для термической фиксации высушенный мазок два-три раза проводится над пламенем горелки или спиртовки

При химической фиксации высушенный мазок погружают (обычно на 10 мин) в один из органических растворителей:метанолэтанолацетонсмесь Никифорова (равные объемы этанола и диэтилового эфира) - неприменима в самодеятельных условияхжидкость Карнуа (60% этанола, 30 % хлороформа, 10 % ледяной уксусной кислоты) - неприменима в самодеятельных условиях

Грам-положительные микроорганизмы окрашиваются обычно в темно-синий или фиолетовый цвет (комплекс первичного красителя с йодом), а при использовании бриллиантового зеленого - в ярко-зеленый, окраска грам-отрицательных микроорганизмов зависит от цвета вторичного (дополнительного) красителя: например, розовая или розово-фиолетовая при окрашивании фуксином, красная при окрашивании сафранином, нейтральным красным или конго краснымИспользована фотография, выполненная Y tambe, CC-BY-SA