ESTUDIO MORFOLÓGICO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS EN SANGRE PERIFÉRICA Y MÉDULA OSEA

Consiste en una capa fina de sangre dispuesta sobre un portaobjetos para realizar un análisis morfológico de sus células con ayuda de un microscopio y, a menudo, de tinciones.

Se debe anticoagular con EDTA.

Con lancetaSe obtiene sangre capilar

Necesitamos dos portaobjetos de vidrio limpios de 7,5 x 2,5 cm con los bordes biselados, uno como soporte y otro como extensor.La extensión se realiza de la siguiente manera:Depositar gota de sangre de 3 mm diámetro (10-15 µl) en el soporte, cerca de uno de los extremosColocar extensor por delante de la gota de sangre formando cuña en un ángulo de 35-45ºDeslizar el extensor un poco hacia atrás para que su borde entre en contacto con la gota de sangre, que se distribuye por capilaridad a lo largo del mismoDeslizar el extensor sobre toda la longitud del soporte en un movimiento rápido, suave y continuo, manteniendo el ángulo entre ambos y una presión homogénea. De esta forma la gota de sangre se distribuye uniformemente formando una monocapa de células que ocupa 2/3 o 3/4 de la longitud del soporteDejar secar la extensión al aire

Sin agujeros ni rayas.

Separados 1 mm de los bordes del portaobjetos

De principio a fin.

Zona inicial, más gruesa. Los hematíes pueden estar formando más de una capa y hay más proporción de linfocitos.

Zona media del frotis. Los hematíes se disponen formando una sola capa y los leucocitos mantienen una proporción equilibrada. Es la zona ideal para realizar el estudio morfológico de las células.

Zona final de la extensión, más fina. Los hematíes se disponen de forma acordonada dejando huecos entre ellos y hay una mayor proporción de leucocitos grandes (granulocitos y monocitos) y plaquetas grandes. La cola termina en forma ligeramente redondeada con borde finamente deshilachado (barbas).

Tinciones que se realizan para colorear las diversas estructuras de las células sanguíneas, aumentando así el contraste entre ellas y el medio que las rodea, y facilitando la identificación de los diferentes tipos celulares al microscopio.

Utilizan combinaciones de colorantes con distintas afinidades para que las estructuras celulares se tiñan con colores diferentes.Se aplican sobre células muertasSe requiere fijación previa (para evitar alteraciones de la estructura celular y facilitar la adherencia al portaobjetos)Tinciones derivadas de la Tinción Romanowsky: Azul de Metileno y Eosina

Muy utilizada en hematologíaSe ioniza en solución acuosaEl colorante de May Grünwald actúa como fijadorSe combinan con los distintos componentes celularesGeneran sales insolubles de distintos coloresMay Grünwald: es una solución de eosina y azul de metileno en metanol, que actúa como fijador.El azul de metileno es un colorante básico (catiónico) con afinidad por los componentes celulares ácidos, como los ácidos nucleicos, a los que tiñe de azul. Las estructuras celulares que fijan colorantes básicos se denominan basófilas.Giemsa: es una mezcla de eosina y derivados del azul de metileno, como el azur I y el azur II.La eosina es un colorante ácido (aniónico) que tiñe de matices de rojo los componentes celulares básicos, como la hemoglobina y otras proteínas básicas y los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos eosinófilos. Las estructuras celulares que fijan colorantes ácidos se denominan acidófilas; y cuando el colorante que fijan es la eosina, se denominan eosinófilas.En un frotis teñido adecuadamente con la técnica de May Grünwald-Giemsa, las estructuras celulares se tiñen de la siguiente forma:Eritrocitos: rosa-salmón.Núcleos de las células: azul oscuro-violeta.Gránulos citoplasmáticos de los leucocitos neutrófilos: azul claro-lila.Gránulos citoplasmáticos de los leucocitos basófilos: azul oscuro-negro.Gránulos citoplasmáticos de los leucocitos eosinófilos: rojo-anaranjado.El área que hay entre las células debe estar limpia y sin precipitados.ProcedimientoNormalmente se utilizan kits comerciales que contienen una solución concentrada de May Grünwald en metanol y una solución acuosa (tamponada o no) concentrada de Giemsa. Para realizar la tinción hay que diluir ambos colorantes teniendo en cuenta la concentración inicial de los reactivos, distinta en cada fabricante.Una vez preparados los reactivos:Colocar la extensión en un puente de tinción sobre un cristalizador o un fregadero.Cubrir la extensión con solución de May Grünwald durante dos minutos (fijación).Volcar la extensión para eliminar el colorante y escurrir.Cubrir la extensión con solución diluida de May Grünwald durante un minuto.Volcar la extensión para eliminar el colorante, lavar con agua destilada y escurrir.Cubrir la extensión con solución diluida de Giemsa durante 20 minutos.Volcar la extensión para eliminar el colorante, lavar, escurrir y dejar secar al aire.

HabitualUn único colorante que combina Eosina, Azul de Metileno y derivados de este último en metanolConsta de dos pasosProcedimientoLa tinción se realiza con un colorante pero en dos pasos. Primero se incuba con el colorante sin diluir, y luego con una dilución tamponada del mismo colorante.Los pasos que se deben seguir son estos:Colocar la extensión en un puente de tinción sobre un cristalizador o un fregadero.Cubrir la extensión con colorante de Wright sin diluir durante 5-8 minutos. El metanol fija la extensión y se inicia la tinción de las células.Volcar la extensión para eliminar el colorante y escurrir.Cubrir la extensión con una dilución del colorante de Wright en tampón de pH 7,2 durante unos 10-15 minutos. En esta fase se completa la tinción de las estructuras celulares.Volcar la extensión para eliminar el colorante, lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire.

Muy utilizada en laboratorios de urgenciasCombina las técnicas anteriores para conseguir mayor rapidezUtiliza tres reactivos: solución fijadora, colorante ácido tamponado y colorante básico tamponadoIncubaciones por inmersión secuencialProcedimientoA diferencia de las técnicas anteriores, las incubaciones se realizan por inmersión secuencial. Es necesario, por tanto, preparar tres cubetas de tinción con los tres reactivos y sumergir la extensión primero en la de solución fijadora, luego en la de colorante ácido tamponado y finalmente en la de colorante básico tamponado.Cada inmersión debe durar solo 5-10 segundos (también se pueden hacer varias inmersiones de un segundo cada una) y no es necesario realizar lavados intermedios entre una y otra, basta con escurrir el exceso de cada reactivo sobre papel de filtro.

Diseñadas para la observación de células vivas, no requiriendo una fijación previa.En este tipo de tinciones, primero se realiza la tinción, mezclando el colorante con la sangre, y después se realiza la extensión sobre el portaobjetos para visualizarla al microscopio.

Para reticulocitos (hematíes inmaduros), que aún conservan algunos orgánulos celulares (ribosomas, mitocondrias) y restos de ARN.ProcedimientoEl procedimiento se realiza en tres pasos:Introducir en un tubo de hemólisis cantidades iguales (por ejemplo, 3 gotas) de la solución colorante y de sangre periférica anticoagulada con EDTA. Mezclar suavemente y cerrar el tubo con parafilm para evitar la desecación.Incubar cinco minutos en baño María a 37 ºC.Homogeneizar suavemente la mezcla, depositar una gota sobre un portaobjetos limpio y realizar una extensión, que se deja secar al aire.Con esta tinción, los hematíes se tiñen de color verde pálido y los reticulocitos se diferencian porque en su interior se observan estructuras granulares y/o filamentosas de color azul.

Permiten detectar actividades enzimáticas, principios inmediatos, elementos inorgánicos o moléculas específicas de utilidad en el diagnóstico y seguimiento de hemopatías.Más habituales en extensiones de médula osea.

Útil en extensiones de sangre periféricaDetecta actividad enzimática en los gránulos secundarios de leucocitos neutrófilosSe emplea para el estudio de síndromes mieloproliferativos

Imprescindible en el diagnóstico hematológicoPermite detectar y confirmar alteraciones cuantitativas y/o morfológicas de eritrocitos, leucocitos y plaquetasSus indicaciones son el hemograma con desviación significativa en los recuentos directos, indirectos o calculados, la sospecha clínica de enfermedad hematológica y la sospecha clínica de enfermedad de origen no hematológico con manifestaciones hematológicas (enfermedades parasitarias o infecciosas, tratamientos oncológicos...), aunque los parametros del recuento estén dentro de los rangos esperados por edad y sexo

Como filarias.

Plaquetas y hematíes, así como apilamiento de hematíes (rouleaux).

Como blastos.

En concreto, la presencia de acúmulos de células nucleadas grandes (monocitos, neutrófilos) en la cola y los bordes, el cual es criterio suficiente para repetir la extensión.

Se localiza una zona del cuerpo del frotis en la que los hematíes se distribuyan uniformemente sin que apenas se toquen los unos con otros.

Procedimiento:Se cuentan los leucocitos presentes en 10 campos de 40x de la zona seleccionada.Se calcula la media de leucocitos por campo y se multiplica por 2.000.Esta aproximación sirve de control de calidad para detectar discrepancias con el recuento automático.

El examen más exhaustivo de la extensión sanguíneaSi el área que se examina es la correcta, en cada campo se observan alrededor de 200-250 hematíes sin que apenas contacten unos con otrosEn este examen a gran aumento se analizan las tres series: leucocitos, eritrocitos y plaquetas.

Recuento diferencial de leucocitos o formula leucocitaria, que implica el recuento de 100 leucocitos para expresar en % la proporción de los distintos tipos de leucocitos presentes en la extensión, incluyendo, si es el caso, las células inmaduras o blastosAnálisis morfológico de los leucocitos para detectar cualquier alteración (cuerpos de Döhle, Bastones de Auer, Linfocitos reactivos, Disgranulopoyesis)

Detección y recuento de eritroblastos (hematíes nucleados). El resultado cuantitativo se expresa como número de eritroblastos por cada 100 leucocitosAnálisis morfológico de los eritrocitos para detectar posibles inclusiones (cuerpos de Howell-Jolly, punteado basófilo) y/o formas anómalas (hematíes falciformes, esquistocitos, dianocitos, acantocitos...), importantes en el diagnóstico de algunas patologías

Estimación del recuento de plaquetas/mm3. Para hacerla se cuentan las plaquetas presentes en 10 campos en los que los hematíes no se toquen, se calcula el promedio por campo y se multiplica por 20.000Detección de agregados plaquetarios, fundamental para distinguir auténticas trombopenias de las pseudotrombopenias, en las que el recuento automático es bajo por la presencia de dichos agregados

Aspecto de la cromatinaNúmero y aspecto de los nucleólos

CantidadPropiedades tintorialesPresencia/ausencia de gránulosAspecto, tamaño y propiedades tintoriales de los gránulos

Consiste en una capa fina de un aspirado de médula ósea dispuesta sobre un portaobjetos para realizar un análisis morfológico de sus células con ayuda de un microscopio y, a menudo, de tinciones.Permite el análisis morfológico de células hematopoyéticasAplicaciones en el estudio de enfermedades hematológicas y algunas no hematológicas (metátasis de tumores, enfermedades por acúmulo - Enfermedad de Gaucher - y enfermedades infecciosas o parasitarias - tuberculosis y leishmaniosis -)

En huesos que conservan la hematopoyesis: cresta iliaca posterior superior, anterior y del esternón. En niños en tibiaBasta con 0,5 ml de aspirado, pero a veces más de 5 ml

Material propio de la médula ósea

Células hematopoyéticas y estromales del tejido conectivo.

En proporción variable.

Procedente de la vascularización de la médula. Se habla también de sangre sinusal.En determinadas ocasiones es imposible obtener grumo o sangre medular al practicar un aspirado medular. Esta circunstancia recibe el nombre de «punción blanca» o «punción seca». Sin embargo, esta circunstancia no indica que la médula sea hipocelular, por lo que en estos casos está indicado realizar una biopsia.

Para la realización de estudios celulares complementarios.

Junto con la sangre sinusal.

ProcedimientoColocar un pequeño volumen de aspirado medular que contenga grumo en un portaobjetos limpio, próximo a uno de sus extremos.Apoyar suavemente otro portaobjetos limpio sobre el anterior, de manera que el grumo se aplaste ligeramente. Los portaobjetos se colocan de manera que queden libres extremos opuestos de ambos.Sujetar los extremos libres de los portaobjetos, cada uno con una mano, y deslizar uno sobre otro, de manera que el material aplastado se extienda sobre el portaobjetos en forma ovoide.Dejar secar la extensión al aire.En este procedimiento, el factor que más influye en la calidad de la extensión es la presión ejercida al deslizar un portaobjetos sobre el otro. Debe ser suficiente para aplastar el grumo y hacer que todo el material se extienda uniformemente sobre el portaobjetos, pero no excesiva para evitar que se rompan las células.

Cuando el grumo es muy escaso o solo disponemos de sangre medular.

Tiempos más largos de incubación con colorantes, ya que las extensiones medulares tienen un mayor grosor.Con estas tinciones, el tejido conectivo y la matriz extracelular presente en el grumo se tiñen de color azul oscuro o púrpura. Las demás estructuras celulares se tiñen igual que en los frotis de sangre periférica.

Necesarias debido a similitudes morfológicas. Además mejoran la diferenciación celular.Detectan:Actividad enzimáticaPrincipios inmediatosElementos inorgánicosMoléculas relevantes en diagnóstico y seguimiento de hemopatías

Se basan en reacciones químicas sencillas que originan productos coloreados y que ponen de manifiesto determinados componentes celulares.

La tinción de Perls o azul de Prusia se utiliza para poner de manifiesto la presencia de hierro iónico intracelular y más concretamente la hemosiderina.Se observan depósitos azul turquesa en el citoplasma de las células que contienen hierro.La valoración del hierro macrofágico da una idea de los depósitos de hierro del organismoLa tinción de Perls se puede realizar también sobre extensiones de sangre periférica para poner de manifiesto los siderocitos o hematíes con depósitos de hierro (< 1% en frotis normales).

La tinción de PAS (ácido peryódico-Schiff) se utiliza para poner de manifiesto glucógeno y mucopolisacáridos.La reacción colorea de rojo púrpura intenso los mucopolisacáridos, glucógeno y mucoproteínas neutras y de rosa pálido las glicoproteínas. Los núcleos suelen teñirse de azul por la coloración de contraste.Es especialmente útil en el diagnóstico de la leucemia linfoblástica aguda y de la eritroleucemia.

La mieloperoxidasa es una enzima sintetizada en el retículo endoplasmático rugoso de las células mieloides, de donde pasa a las cisternas del aparato de Golgi, quedando localizada, fundamentalmente, en la granulación primaria azurófila.La reacción enzimática tiñe de marrón los gránulos citoplasmáticos de neutrófilos, eosinófilos y monocitos, por su contenido en peroxidasa.La aplicación fundamental de la MPO se refiere a su capacidad discriminatoria entre celularidad blástica mieloide (MPO positiva) y linfoide (MPO negativa).

Las esterasas son enzimas que hidrolizan ésteres. Existen varias enzimas con actividad esterasa que se diferencian unas de otras por su capacidad para hidrolizar sustratos diferentes.Los resultados dependen de la sal diazoica utilizada. Cuando se usa pararrosa-anilina, en el citoplasma de las células positivas se observa un precipitado rojo/anaranjado-pardo de intensidad variable, difuso o focal, dependiendo del tipo celular.Los distintos tipos celulares encontrados en una médula ósea tienen distintos patrones de actividad esterasa, por lo que la combinación de las tres tinciones, junto con estudios de inhibición de la actividad con sustancias como el fluoruro sódico, permite distinguir entre precursores morfológicamente similares. En este sentido son especialmente útiles en el diagnóstico de leucemias agudas

EZ que hidroliza monoésteres del ácido fosfórico a pH ácidoLos resultados dependen de la sal diazoica utilizada. Cuando se usa pararrosa-anilina, en el citoplasma de las células positivas se observa un precipitado rojo/anaranjado.Útil en la identificación de leucemia de células vellosas

Se basan en la utilización de anticuerpos específicos para detectar moléculas (marcadores) que caracterizan poblaciones celulares concretas.Es un método sencillo y potente de identificación de poblaciones celulares.Requiere de un sistema de visualización basado en marcadores de fluorocromos y enzimas (peroxidasa y fosfatasa alcalina).Se aplica en la identificación y clasificación de células neoplásicas.

Si se usa peroxidasa y diaminobencidina se obtiene una coloración marrónSi se usa fosfatasa alcalina y fast red se obtiene una coloración rojiza.

Se evaluan aspectos como:Leucopoyesis: se evalúan la morfología y el estado de los elementos mieloides y linfoides, los tipos de maduración, el predominio de alguna serie o tipo celular y la presencia de formas anormales.Eritropoyesis: se analiza la proporción relativa de los distintos elementos de la serie roja, las formas de maduración y la presencia de elementos anormales.Trombopoyesis: se evalúa el número y estado funcional de los megacariocitos y la morfología de las plaquetas.Sistema retículo-endotelial: se analiza la morfología de los elementos reticulares y de las células plasmáticas.Elementos anormales: se valora la presencia de células neoplásicas metastásicas, reacciones granulomatosas, fenómenos tesaurismóticos, parásitos, etc.

Parámetros:Presencia de grumo: si es inexistente, no es valorableCelularidad global: se valora entre 1 y 4, normal > 3Relación mieloeritroide: proporción entre el número de células de la serie mieloide y el de la serie eritroide. Normal de 3 a 1.Cantidad de grasa: vacuolas redondeadas sin teñir en el seno del grumo.Alteraciones estromales: como fibrosis, necrosis o transformación gelatinosa, que aconsejan realizar estudio anatomopatológico de biopsia ósea.Presencia de algunos tipos celulares medulares: como megacariocitos, mastocitos, células plasmáticas, osteoclastos y osteoblastos.Presencia de elementos celulares extramedulares: sobre todo células metastásicas.Presencia de parásitos: como las filarias.

Recuento diferencial de los elementos que componen la celularidad medular, expresándose porcentualmente la proporción de cada tipo celular. Debido a la gran variedad de células y su distribución irregular en la extensión, es preciso contar, como mínimo, 300 células para que los resultados sean precisos.

En la actualidad existen en el mercado multitud de teñidores automáticos, controlados por microprocesadores y basados en brazos robotizados, que lo mismo transportan cestillos con las preparaciones y los sumergen en cubetas con los colorantes, que pipetean y dispensan los reactivos secuencialmente sobre las extensiones colocadas en soportes horizontales. Un tipo especial son los inmunoteñidores, adaptados para la realización de técnicas de inmunocitoquímica.En los sistemas automáticos globales más modernos, un software selecciona las muestras de sangre periférica que requieren un estudio morfológico microscópico, realiza las extensiones mediante un extensor, las tiñe, escanea las preparaciones con un sistema de visualización microscópica y calcula la fórmula leucocitaria mediante un software experto de análisis de imagen.

PortaobjetosLos portaobjetos utilizados deben estar limpios y desengrasados. Las extensiones realizadas con portaobjetos sucios con polvo y partículas se caracterizan por presentar rayas así como colas irregulares . Si además hay restos de grasa, aparecen agujeros en la extensión.Muestra de sangreHay dos factores relacionados con la muestra de sangre que influyen en la calidad de la extensión:Volumen de sangre utilizado: si el volumen de sangre es excesivo, se obtienen extensiones muy gruesas, sin zona de cola, que ocupan toda la longitud del portaobjetos soporte.Por el contrario, las extensiones obtenidas a partir de volúmenes muy pequeños de sangre son muy cortas, por lo que es difícil diferenciar las tres zonas de la extensión.Anticoagulación de la sangre: las mejores extensiones se consiguen con sangre anticoagulada con EDTA.Cuando la extensión se realiza a partir de una gota de sangre capilar, hay que proceder con cierta rapidez para evitar que la sangre empiece a coagular. En caso contrario se obtienen extensiones artefactadas con una distribución de células no uniforme.Ejecución de la técnicaDistribución de la sangre por el canto del portaobjetos extensor: antes de iniciar el deslizamiento del portaobjetos extensor sobre el soporte hay que permitir que la sangre se extienda por todo el ancho del portaobjetos extensor. En caso contrario se obtienen extensiones muy estrechas no valorables.Ángulo del portaobjetos extensor respecto del soporte: el ángulo formado por ambos portas influye en la longitud de la extensión. Ángulos demasiado amplios (> 45º) determinan extensiones cortas y gruesas y ángulos pequeños (< 35º) determinan extensiones largas y excesivamente finas.Velocidad de deslizamiento del portaobjetos extensor sobre el soporte: el portaobjetos extensor se debe deslizar sobre el soporte a una velocidad constante. En caso contrario, se alternan zonas gruesas y finas en la extensión, que presenta un aspecto «en persiana».Presión ejercida durante el deslizamiento del portaobjetos extensor: al deslizar el portaobjetos extensor se debe mantener una presión homogénea y uniforme sobre todo su ancho. Cuando se presiona más un lado del portaobjetos que el otro, se obtienen extensiones con bordes de distinta longitud y distribución anómala de las células.