Preparação Histológica

COLETA DE MATERIAL

Para que uma amostra de tecido seja analisada microscopicamente, é preciso, antes de tudo, que seja retirada do organismo, vivo ou morto, por meio de biópsia e/ou durante uma cirurgia, ou necropsia, respectivamente (CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2010).

OBS.: A espessura ideal é de 4-6 mm.

CLIVAGEM

Após o processo de fixação, é necessário que seja feita a clivagem do material, ou seja, reduzir o tamanho das peças com o intuito de facilitar a penetração da substância fixadora em menor tempo, evitando assim, o processo de autólise (MICHALANY, 1990).

Por padrão, os fragmentos teciduais devem ter cerca de 3 mm de espessura, mas em 35 alguns casos o fragmento pode chegar a 5 mm (CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2010).

MICROTOMIA

Para que seja possível analisar um tecido em microscópio óptico, é necessário que esteja disposta na lâmina uma seção bem fina do tecido. Rotineiramente, nos laboratórios recomenda-se a espessura de 4 a 6 micrômetros, que é a espessura ideal para a passagem de luz e evidenciação do tecido em microscópio (MICHALANY, 1990; CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2010).

O equipamento utilizado para a obtenção dos cortes é o micrótomo, composto por três peças principais: o corpo, o porta-bloco e o porta-objeto, além da navalha. Há vários tipos de micrótomo, como o criostato, o micrótomo de congelação, o ultramicrótomo, o do tipo serra e o vibratório.

FIXAÇÃO

A fixação é a fase destinada a interromper o processo de autólise pelo qual qualquer tecido passa ao ser retirado do organismo ou após a sua morte (CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2010).

Além de interromper o metabolismo celular, conservando o aspecto natural dos tecidos, a fixação estabiliza as estruturas bioquímicas intra e extracelulares, permite a penetração de outros reagentes necessários no decorrer de todo o processamento histológico (como os agentes de coloração, por exemplo), impede que o tecido seja colonizado por micro-organismos e faz com que a amostra comece a endurecer (MICHALANY, 1990; CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2010, AARESTRUP, 2012).

Fixadores usados: formaldeído 4% gluteraldeído, cloreto de mercúrio, ácido pícrico e etanol.

PROCESSAMENTO

O processamento técnico propriamente dito consiste em uma preparação para que as peças sejam, posteriormente, emblocadas em parafina (ou produtos similares) e cortadas em fatias muito finas, a fim de que possam ser observadas as estruturas teciduais em microscópio óptico (CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2010).

DESIDRATAÇÃO

O material biológico, mesmo após a fixação, ainda retém cerca de 85% de água em seu interior (MICHALANY, 1990) e, como se sabe, a parafina é um produto derivado do petróleo, portanto, insolúvel em água. Desta forma, para que ela consiga penetrar no tecido processado, é necessário que a água presente seja retirada.

Diversas substâncias desidratantes são eficazes, variando apenas o tempo de desidratação. Entre elas, pode-se citar os álcoois butílico, isopropílico e metílico, a acetona, o éter, o clorofórmio e o óxido propileno (MICHALANY, 1990; CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2010).

DIAFANIZAÇÃO

Como dito anteriormente, a parafina é insolúvel em água, e muito pouco em álcool. Desta maneira, faz-se necessário que o álcool presente nas peças após o processo de desidratação seja substituído por um produto com o qual a parafina tenha afinidade (MICHALANY, 1990).

Dentre os produtos diafanizadores conhecidos estão o xilol, toluol, benzeno, óleo de cedro e os solventes universais acetato butílico, dióxido dietileno e benzoato metílico (SOUZA JUNIOR, 2010)

IMPREGNAÇÃO

Nessa etapa, as peças são infiltradas por alguma substância de consistência firme para que adquiram rigidez suficiente e seja possível a realização de cortes finos.

São vários os materiais utilizados para esse fim, como parafina, resina, ágar, gelatina, parafina plástica, goma arábica, polietileno glicol, parafina esterificada e celoidina (SUVARNA; LAYTON; BANCROFT, 2013; SOUZA JUNIOR, 2010), porém as mais utilizadas no processamento histológico de rotina são a parafina e a resina.

INCLUSÃO

Na inclusão a parafina envolve o exterior da peça e, após esfriar e endurecer, forma um bloco que será submetido posteriormente à microtomia (AARESTRUP, 2012).

COLORAÇÃO

Após os procedimentos realizados, as células se encontram incolores, transparentes. Portanto, para que seja possível sua visualização em microscópio óptico, é necessário que os tecidos sejam corados.

Há diversos tipos de corantes utilizados, naturais ou artificiais, que podem se ligar a estruturas celulares específicas, de acordo com sua afinidade química (MICHALANY, 1990; SOUZA JUNIOR, 2010). A coloração dos tecidos pode ser feita através de corantes, de reações químicas especiais (histoquímica) ou de deposições metálicas (MICHALANY, 1990).