PCR
(Reacción en cadena de la polimerasa)
Técnica utilizada en biología molecular
que permite conseguir una gran cantidad de copias de un fragmento de ADN, partiendo de una cantidad ínfima de esta biomolécula
¿Qué se necesita para hacer una PCR?
ADN molde
fragmento de ADN
que queremos amplificar
mediante la PCR
Desoxirribonucleótidos-trifosfato
ADN está compuesto por 4 tipos de nucleótidos, formados por 4 bases nitrogenadas: adenina, guanina, citosina y timina. Es de esperar, entonces, que estos 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato sean indispensables para poder obtener nuevas moléculas de ADN
Cebadores
son oligonucleótidos, secuencias cortas de ADN, que se unen a la molécula de ADN molde y sirven como punto de inicio para comenzar la síntesis de ADN
ADN polimerasas
La más utilizada dada su efectividad, es la ADN polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus, también llamada Polimerasa Taq
Iones divalentes de magnesio
se utilizan iones de carga positiva como cofactores de la polimerasa. Estos cationes son esenciales para la función de la ADN polimerasa. Normalmente se añade cloruro de magnesio para que al disociarse se libere magnesio
Solución tampón
Una solución tampón es una disolución que es capaz de regular el pH, es decir, las condiciones de acidez o basicidad, de nuestra PCR
Termociclador
Un termociclador es un aparato que regula la temperatura en cada ciclo de la PCR
Otros tipos de PCR
PCR digital
cuantificación absoluta
tiene cuatro pasos
preparación de la muestra
La división o distribución
La amplificación por PCR
Obtención de datos
tiene una variante llamada DDPCR
Utiliza un dos sistemas micro fluidos
uno al principio y otro al final del proceso
El flujo sale en forma de burbujas
se acopla un un detector lumisente,
RT-PCR
PCR cuantitativa
PCR múltiple
PCR in situ
PCR anidada
La PCR digital como herramienta
para medir la
persistencia del VIH
El virus persiste y se recupera cuando se interrumpe el tratamiento
Se debe poder cuantificar el virus persistente
Utilizado PCR en tiempo real (qPCR)ic
la PCR digital está ganando popularidad
Disponibles varias plataformas comerciales de PCR digital
Pero QX200 ddPCR de Bio-Rad es actualmente la plataforma más utilizada en la investigación del VIH
Desventajas
Las plataformas digitales de PCR actualmente disponibles luchan ocasionalmente con particiones falsas positivas inexplicables
la segregación confiable entre gotitas positivas y negativas sigue siendo cuestionada
Ventajas
avances futuros de la tecnología de PCR digital son prometedores
para ayudar en la cuantificación y caracterización precisas del reservorio persistente del VIH