Técnicas de Cromatografía y Electroforesis.
Cromatografía en papel
fundamento
Técnica basada en la diferencia de polaridad de los componentes de la mezcla.
fases
Estacionaria: Celulosa con agua dentro de un soporte (el papel).
Móvil: Solventes
ejemplos
Cromatografía en capa fina (TLC)
fundamento
Técnica basada en la diferencia de polaridad de los componentes de la mezcla.
fases
Estacionaria: Placa de vidrio con gel de sílice sílice (SiO2) y
a alúmina (Al2O3), amabas polares.
Móvil: Solventes de menor polaridad, eluyentes.
ejemplos
Cromatografía de Exclusión Molecular
Filtración en Gel
FUNDAMENTO
Separa moléculas en base a su tamaño mediante un gel que contiene poros de tamaños específicos.
Eluyendo primero las partículas de mayor tamaño y siendo las más pequeñas las últimas en eluir.
FASES
Fase Estacionaria
Gel con partículas esféricas que contienen los poros.
Cada gel tiene un intervalo de fraccionamiento que nos permite considerar el tamaño de las moléculas a separar.
Fase Móvil
Cualquier solución que no desnaturalice la molécula.
Buffer pH=7
CROMATOGRAMA
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Primer pico - Moléculas rojas
Segundo pico - Moléculas verdes
Segundo pico - Moléculas azules
FUENTES
Mayolo-Deloisa, K., Martínez, L., & Rito-Palomares, M. (n.d.). Técnicas cromatográficas y su aplicación a estudios de cambios conformacionales, estabilidad y replegamiento de proteínas. https://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1665-27382012000300006
Osorio Zapata, G. V., & Picado Peñalba, E. E. (2005). Estudio preliminar para el desarrollo del método" determinación de aniones en aguas naturales por cromatografía de intercambio iónico (Doctoral dissertation).
Ejemplo de Cromatografía de Intercambio Catiónico
Extracción y purificación parcial de peroxidasa de
rabano (Raphanus sativus)
Fase móvil: Es el eluyente utilizado en la cromatografía de intercambio catiónico con carboximetil-celulosa (CM-52). Aquí se usaron gradientes de acetato de sodio en concentraciones crecientes (5 mM, 50 mM, 100 mM y 250 mM) a pH 4.4 y 4.9.
Fase estacionaria: Es la matriz de carboximetil-celulosa (CM-52) utilizada como soporte para el intercambio catiónico.
A. Perfil cromatográfico (parte superior del gráfico)
Eje X (Número de fracción): Representa las fracciones recolectadas durante el proceso de elución. Cada fracción contiene una muestra del eluido de la columna.
Eje Y izquierdo (Absorbancia a 280 nm): Indica la cantidad de proteínas presentes en cada fracción, medida por su absorbancia en 280 nm, que detecta aminoácidos aromáticos.
Eje Y derecho (Concentración de acetato de sodio): Muestra el gradiente de concentración del eluyente (acetato de sodio) utilizado para liberar las proteínas unidas a la fase estacionaria.
Picos en el gráfico:
Cada pico corresponde a una población de proteínas que se eluyen de la columna a diferentes concentraciones de acetato de sodio.
Pico principal (250 mM, pH 4.9): Se observa el pico más grande, que indica una alta concentración de proteínas que se eluyeron en esta etapa. Estas proteínas incluyen las isoformas más básicas de la peroxidasa.
Picos más pequeños: Representan proteínas eluidas a concentraciones menores de acetato de sodio (formas ácidas o neutras).
Posiciones relativas de las isoformas (A, B, C, D, E): Basado en estudios previos (Shannon et al.), estas letras indican diferentes isoformas de la peroxidasa que se separan en la columna debido a diferencias en su carga.
B. Actividad enzimática (parte inferior del gráfico)
Eje X (Número de fracción): Igual al gráfico anterior, muestra las fracciones recolectadas durante el proceso de elución.
Eje Y izquierdo (U/mg de proteína): Representa la actividad enzimática específica (Unidades por miligramo de proteína), medida como la capacidad de la enzima para catalizar la reacción.
Eje Y derecho (Unidades totales): Indica la actividad total de las enzimas presentes en cada fracción.
Pico principal (250 mM, pH 4.9): Este pico coincide con el de la absorbancia a 280 nm, indicando que la mayor actividad enzimática se encuentra en la fracción que eluye a esta concentración. Estas son las isoformas más básicas y activas de la peroxidasa.
Los picos reflejan cómo las proteínas y sus actividades se distribuyen entre las fracciones recolectadas.
El pico principal sugiere que la isoforma de mayor interés en este estudio (con mayor actividad específica y total) se encuentra en la fracción eludida a 250 mM de acetato de sodio.
Electroforesis
Fundamento: migración de moléculas a través de una matriz porosa, donde serán separadas según su tamaño o peso molecular por efecto de un campo eléctrico
Gel de agarosa: separa ácidos nucleicos y proteínas plasmáticas
Gel de agarosa
Ácidos nucleicos cargados
negativamente migran al ánodo
Las posiciones (altura) de las
bandas indican sus tamaños
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Gel de poliacrilamida: mayormente separa proteínas
Cromatografía de Intercambio Iónico
Fundamento: separación basada en interacciones electrostáticas entre las moléculas y la fase estacionaria según sus cargas opuestas o iguales.
Fase estacionaria
Resina cargada, puede ser:
-Intercambiador catiónico: carga negativa que retiene iones positivos.
-Intercambiador aniónico: carga positiva que retiene iones negativos.
Intercambio aniónico y catiónico
Fase móvil
-Carga: solución buffer inicial, diseñada para que las moléculas de interés se unan a la fase estacionaria.
-Elución: Cambios controlados en la fuerza iónica (incrementando la concentración de sal) o en el pH.
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Etapas:
-Equilibrio: Acondicionamiento de la columna con un tampón para estabilizar la fase estacionaria.
-Aplicación: Introducción de la muestra, donde los analitos se retienen según su carga.
-Elución: Liberación de analitos por cambios en pH o fuerza iónica.
-Regeneración: Limpieza y restauración de la columna para su reutilización.
Cromatograma
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En un intercambio aniónico, la fase estacionaria está cargada positivamente. Las moléculas negativas se retienen por atracción, mientras que las positivas eluyen primero. Para liberar las negativas, se modifica el pH o se agrega sal. En la curva de elucion, el primer pico corresponde a las positivas y el segundo a las negativas.
Cromatografía de Afinidad
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FUNDAMENTO
Cromatografía de columna que purifica en base a su funcionalidad biológica
Anclando covalentemente a un soporte uno de los complementarios de la molécula
Para separar nuestra molécula se le añade un ligando libre para hacer hacer competencia y eluir nuestra molécula de interés.
Anticuerpo
Antígeno
Enzima
Sustrato
Receptor
Ligando
FASES
Fase Móvil
Mezcla de las proteíanas a separar
Fase Estacionaria
La matriz de gel con la resina de afinidad
CROMATOGRAMA
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El primer pico indicaría todas las moléculas que no son de interés.
El segundo pico indicaría nuestra molécula ligada.
Se desplazan más los componentes de muestra que interactuán mejor con la fase móvil, es decir los más NO polares, los polares establecen interacciones con la fase móvil.
Se desplazan más los componentes de muestra que interactuán mejor con la fase móvil, es decir los más NO polares, los polares establecen interacciones con la fase móvil.