1/3. Что нужно для микроскопии растительных клеток с минимальными затратами?

Одна из наиболее широко применяемых в отечественных исследованиях сред для выращивания инфузорий рода Paramecium - среда Лозино-Лозинского.Обычно она готовится в виде концентрата 10-кратной концентрации (10x). Концентрат среды Лозина-Лозинского готовится следующим образом: в 1 литре дистиллированной воды растворяют 0,1 г NaCl, 0,01 г KCl, 0,2 г NaHCO3, 0,01 г MgSO4 х 7 H2O, 0,01 г CaCl2. Для приготовления рабочего раствора (инкубационной смеси) смешивают 1 объем концентрата с 9 объемами воды (например, 100 мл концентрата + 900 мл воды).Культура парамеций лучше всего выращивать при температуре 20-25˚C с естественной рассеянной освещенностью в течении дня или с искусственным чередованием света и темноты («день-ночь») 12 + 12 часов в течение суток.В качестве корма можно использовать множество веществ и продуктов, но одним из самых простых, доступных и легко стандартизируемых вариантов являются обычные сухие пекарские дрожжи. Активные (быстрорастворимые) дрожжи лучше, чем те, которые требуют предварительной инкубации в жидкости. Рекомендуемый режим кормления 0,07 г сухих дрожжей на культуру объемом 400-600 мл 2 раза в неделю. Перед добавлением в культуру дрожжи суспендируются в 10 мл воды для более равномерного распределения в культуре.Через каждые 1-2 недели культуру инфузорий требуется отмывать от остатков корма и продуктов метаболизма. Для этого культуру инфузорий переливают в узкогорлую колбу, которую накрывают темной тканью, оставляя открытым горлышко. Средой Лозино-Лозинского доводят до верха. Через некоторое время инфузории выплывают в верхнюю часть колбы, после чего их отбирают дозатором на 10 мл и переносят в чистый стакан, а затем снова доливают средой Лозино-Лозинского. Процедура повторяется до тех пор, пока культура не станет прозрачной. После отмывки инфузории необходимо покормить, а на сосуд с ними поставить дату последней отмывки.

Могут быть плохо различимы при слабом увеличении, которое доступно для микроскопов, монтирующихся на смартфоны, и для многих «домашних» микроскопов

формулировать научную гипотезу для последующей экспериментальной проверкиподготавливать образцы для последующей микроскопиивыбирать условия для общей или компонент-специфичной окраски растительных клетокискать замену (альтернативу) лабораторных реактивов (включая красители) среди общедоступных материалов и химикатов

Почему флюоресцентное окрашивание структур клетки часто показывает их как более крупные по размеру, чем окрашивание нефлюоресцентными красителями?Почему работа с растительными клетками имеет меньше этических проблем, чем работа с клетками человека или высших животных?Чем - с точки зрения клеточного строения - отличаются эпидермис луковицы репчатого лука и эпидермис нижней стороны зеленого листа? С чем связано это различие?Чем объяснить различия в наличии или отсутствии определенных видимых признаков под действием абиотических стрессоров при окрашивании препаратов различными красителями?В чем причина отличий в собственной флуоресценции клеток эпидермиса луковицы и зеленых листьев?

Подготовительная часть (преподаватель + лаборант): подготовка необходимых материалов и оборудования.Подготовительная часть (студенты): растворы красителей, приготовленные для лабораторных работ по исследовательскому вопросу 1/2.Основная часть (студенты на занятии): работа 1/3 а выполняется по потребности получения образцов для последующих работ. Работа 1/3 б выполняется в тех же парах, что и работа по исследовательскому вопросу 1/2 (с теми же красителями). Воздействие абиогенных стрессоров проводится одновременно для образцов всех студентов в группе. Работа 1/3 в выполняется индивидуально.Важно! Поскольку студенты работают с разными условиями экспериментов преподавателю следует обеспечить студентам возможность ознакомиться с результатами друг друга. Делать это в ходе выполнения эксперимента или во время заключительного мини-коллоквиума занятия - выбор преподавателя.

Протокол выполнения опытаОбразцы: луковица репчатого лука; зеленые листья растений (желательно с легко отделяемым эпидермисом нижней стороны листа).Получение клеточных образцов эпидермиса луковицыочистите небольшой участок поверхности луковицы от внешних сухих слоев (сухих чешуй);аккуратно снимите участок внешней (или одной из подлежащих) сочной чешуи, стараясь не повредить тонкую пленку межчешуйного эпидермиса;снимите с луковицы участок межчешуйного эпидермиса и перенесите его в плоский сосуд с водой;расправьте пленку эпидермиса в воде, так чтобы она была полностью смочена и не сворачивалась и не сминалась;до проведения экспериментов держите эпидермис в смоченном состоянии (в течение не более 2 часов).Получение клеточных образцов эпидермиса зеленых листьеввозьмите зеленый лист растения с легко снимаемым эпидермисом нижней стороны листа (хорошим вариантом являются листья традесканции, ивы или истинные листья молодых проростков бобовых растений, например, гороха или фасоли);аккуратно подцепите пленку эпидермиса на нижней стороне листа (возможно придется сделать небольшой неглубокий надрез по поверхности) и снимите её - по возможности - полностью;снимите с луковицы участок межчешуйного эпидермиса и перенесите его в плоский сосуд с водой;расправьте пленку эпидермиса в воде, так чтобы она была полностью смочена и не сворачивалась и не сминалась;до проведения экспериментов держите эпидермис в смоченном состоянии (в течение не более 2 часов).

Протокол выполнения опытаКрасители: используется раствор красителя, приготовленный данной парой студентов в ходе лабораторной работы 1/2.Исследуемые клетки: клетки эпидермиса лука; клетки эпидермиса листьев. Работа выполнятся в паре, один из студентов работает с эпидермисом луковицы, другой - с эпидермисом зеленого листа.Световая микроскопия неокрашенных препаратовподготовьте предметное стекло для работы, обезжирив его изопропанолом;отрежьте от образца эпидермиса небольшой участок (по размеру меньше, чем покровное стекло);перенесите кусочек эпидермиса на предметное стекло, аккуратно расправьте его, чтобы он не сминался (это важно для получения монослоя клеток);нанесите на эпидермис немного воды, чтобы слегка смочить его по всей площади;положите на препарат эпидермиса покровное стекло и аккуратно прижмите его для фиксации (если необходимо, уберите выступивший излишек воды фильтровальной бумагой);изучите получившийся препарат путем микроскопирования с помощью лабораторного настольного микроскопа (с установленным видеоокуляром или со встроенной камерой) и микроскопа, монтирующегося на смартфон, и/или недорого компактного настольного цифрового микроскопа;сделайте фотографии, которые позволят сравнить степень увеличения, резкость и разрешающую способность разных микроскопов.Световая микроскопия окрашенных препаратоввыполните предыдущий протокол, но с предварительным окрашиванием эпидермиса красителем из работы 1/2;приготовьте 4 кусочка эпидермиса;перед переносом на предметное стекло поместите кусочки эпидермиса в растворы изучаемого красителя с концентрацией 0,25%, 0,1%, 0,05% и 0,01% на 10 минут;после окрашивания удалите краситель и промойте эпидермис двумя-тремя порциями дистиллированной воды;перенесите эпидермис на предметные стекла и проведите микроскопирование с помощью различных микроскопов;сделайте фотографии, которые позволят сравнить степень увеличения, резкость и разрешающую способность разных микроскопов.Изучение различных абиогенных стрессоров на препараты эпидермиса растенийпроведите микроскопическое изучение окрашенных и неокрашенных препаратов после воздействия нескольких различных абиогенных стрессоров;виды абиогенных стрессоров (растворы различных концентраций солей или разбавленных кислот или щелочей, других химических соединений, воздействие ультрафиолетового излучения или видимого света и т.п.) выбираются группой в ходе совместного обучения во время вводного мини-коллоквиума занятия.

Протокол выполнения опытаКрасители: акридиновый оранжевый, тетрациклина гидрохлорид, нейтральный красный.Исследуемые клетки: клетки эпидермиса лука; клетки эпидермиса листьев. Работа выполнятся в паре, один из студентов работает с эпидермисом луковицы, другой - с эпидермисом зеленого листа.Микроскопия собственной флюоресценции клетокподготовьте предметное стекло для работы, обезжирив его изопропанолом;отрежьте от образца эпидермиса небольшой участок (по размеру меньше, чем покровное стекло);перенесите кусочек эпидермиса на предметное стекло, аккуратно расправьте его, чтобы он не сминался (это важно для получения монослоя клеток);нанесите на эпидермис немного воды, чтобы слегка смочить его по всей площади;положите на препарат эпидермиса покровное стекло и аккуратно прижмите его для фиксации (если необходимо, уберите выступивший излишек воды фильтровальной бумагой);изучите получившийся препарат путем микроскопирования с помощью люминесцентного микроскопа (лабораторного и/или сопрягаемого со смартфоном) при различных длинах волн возбуждения.Флуоресцентная микроскопия окрашенных препаратоввыполните предыдущий протокол, но с предварительным окрашиванием эпидермиса растворами акридинового оранжевого, нейтрального красного или тетрациклина (различные концентрации, выдаются преподавателем);приготовьте 4 кусочка эпидермиса;перед переносом на предметное стекло поместите кусочки эпидермиса в растворы изучаемого красителя на 2, 5 и 10 минут;после окрашивания удалите краситель и быстро промойте эпидермис дистиллированной водой;перенесите эпидермис на предметные стекла и изучите получившийся препарат путем микроскопирования с помощью люминесцентного микроскопа (лабораторного и/или сопрягаемого со смартфоном) при различных длинах волн возбуждения.Изучение различных абиогенных стрессоров на препараты эпидермиса растенийпроведите микроскопическое изучение окрашенных и неокрашенных препаратов после воздействия нескольких различных абиогенных стрессоров (окрашивание акридиновым оранжевым или тетрациклином, выберите оптимальное время окрашивания из предыдущего эксперимента);виды абиогенных стрессоров (растворы различных концентраций солей или разбавленных кислот или щелочей, других химических соединений, воздействие ультрафиолетового излучения или видимого света и т.п.) выбираются группой в ходе совместного обучения во время вводного мини-коллоквиума занятия.

Выполняется внеаудиторно. Загружается дистанционно для оценки преподавателем с использованием выбранного формата интерактивного общения (LMS, облачное файлохранилище, социальные сети, онлайн-сервисы организации совместной работы и т.д.).

В свободной форме, отражающей:цель эксперимента,протокол выполнения работы,пошаговые иллюстрации выполнения протокола в виде фото- или видеофайлов:общий вывод.

В свободной форме, обязательно отражающей:цель эксперимента,проверяемую научную гипотезу (формулируется самим студентом),протокол экспериментов с различными условиями проведения,результаты экспериментов,сравнительный анализ результатов микроскопии различных типов эпидермиса с обязательной оценкой морфологических особенностей и клеточного состава,сравнительный анализ результатов микроскопии неокрашенных и окрашенных препаратов,обсуждение результатов воздействия абиогенных стрессоровобщий вывод с указанием, была ли подтверждена научная гипотеза.Эссе рекомендуется сопровождать изображениями и / или видеофайлами, полученными в ходе экспериментов.

В свободной форме, обязательно отражающей:цель эксперимента,проверяемую научную гипотезу (формулируется самим студентом),протокол экспериментов с различными условиями проведения,результаты экспериментов,сравнительный анализ результатов микроскопии различных типов эпидермиса с обязательной оценкой морфологических особенностей и клеточного состава,сравнительный анализ результатов микроскопии неокрашенных и окрашенных препаратов,обсуждение результатов воздействия абиогенных стрессоровобщий вывод с указанием, была ли подтверждена научная гипотеза.Эссе рекомендуется сопровождать изображениями и / или видеофайлами, полученными в ходе экспериментов.

Suslov D., Verbelen J.-P., Vissenberg K. Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants. J. Exp. Botany. 2009; 60(14): 4175-4187. doi: 10.1093/jxb/erp251

Студентам необходимо подумать над вопросом: почему работа с растительными клетками имеет меньше этических проблем, чем работа с клетками человека или высших животных?