Coloración , Técnicas y Fundamentos de la estructura bacteriana

Extensión de la muestra

Se coloca una gotita de agua sobre el portaobjetos, luego con el asa bacteriológica se toma una asada del cultivo bacteriano de estudio para hacer un frotis en la lámina portaobjetos

Fijación de la muestra

Se fija la muestra con calor utilizando un mechero

Se pasa el portaobjetos sobre la llama del mechero con la muestra mirando hacia arriba

Coloración

Se añade el cristal violeta hasta cubrir toda la muestra y se deja actuar durante 1 minuto. A continuación se enjuaga con agua

Se agrega lugol y se espera un minuto aproximadamente

Se lava nuevamente con agua y luego con alcohol acetona entre 5 y 30 segundos hasta que no haya residuos de colorante a la vista. Luego se enjuaga con abundante agua

Se realiza la tinción de contraste agregando safranina de 30 a 60 segundos

Se lava la lámina con la muestra levemente con agua

Observar en el microscopio a 100x agregando aceite de inmersión

Se observan bacterias gram positivas de color azul-violeta y bacterias gram negativas de color rosado intenso

Las Gram positivas poseen una pared que consta de una gruesa capa de peptidoglicano que se deshidrata con alcohol, cerrando porosidades y evitando así que el complejo formado entre el yodo (Lugol) y un colorante de anilina (Cristal Violeta) pueda salir de la célula.

Por otro lado en las bacterias Gram negativas la capa de peptidoglicano de la pared es más delgada, permitiendo la entrada del decolorante, lo que genera una pérdida del color violeta inicial, necesitándose así; de una tinción de contraste, como la safranina o fucsina de Gram para ayudar a la visualización de estas bacterias

Colocar una gota de solución salina fisiológica sobre una lámina portaobjeto limpia y desengrasada.

Tomar una asada del cultivo microbiano puro y disolver formando una suspensión.

Luego colocar una gota de tinta china o nigrosina y mezclar

Después se coloca una lámina cubreobjeto sobre la preparación sin que se rebase el líquido

Se observa al microscopio enfocando primero en objetivo de 10X para tener una visión amplia del campo. Posteriormente se debe buscar si hay espacios claros; si los hay, enfocar con 40X

La cápsula se observa como un halo claro y nítido en torno a una levadura redonda, delimitada por las partículas de carbón en suspensión coloidal de la tinta china, exhibiendo un nítido contraste

La técnica de tinción negativa usa como material a la nigrosina (La nigrosina es un colorante aniónico de color negro que tiene como componentes a modificadores de pH, humectantes que retarda el secado prematuro, resinas poliméricas para impartir propiedades de unión, agentes antiespumantes para regular la eficiencia, agentes tensoactivos para controlar las propiedades de superficie , espesantes y biocidas que inhiben el crecimiento de hongos y bacterias

Colocar una gota de SSF o agua destilada esteril en una lámina portaobjeto limpia y desengrasada

Tomar una asada del cultivo puro de la cepa sospechosa y hacer una suspensión

Seguidamente colocar una gota de la suspensión en una lamina portaobjeto y hacer la extensión

Dejar secar a temperatura ambiente

Cubrir el frotis con tinte verde de malaquita durante un minuto

Calentar hasta que el colorante empiece a evaporarse o humee

Seguidamente , lavar con agua destilada, hasta que ya no haya desprendimiento de colorante

Agregar safranina al 0.5% durante 30 segundos

Lavar con agua destilada y dejar secar

Observar al microscopio, con objetivo 100x

Las células se van a teñir de rosa y las esporas se van a teñir de color verde .

Si las células han esporulado , las esporas van a estar fuera de la célula estando el color verde (esporas) fuera de la célula denominándose exosporas

Se aplica un colorante primario, en este caso el colorante verde de malaquita, en una solución acuosa a la muestra

Se le lleva a calentar para desprender vapores y hacer que incremente la penetración de los recubrimientos que son impermeables de las esporas.

Las esporas que son sometidas de manera correcta a este método resisten la sustitución hecha por el colorante de contraste (Safranina) y se pueden observar de color verde dentro de unas células de color rosa.

Extensión de la muestra

Colocar una gota de SSF o agua destilada estéril en una lámina portaobjeto limpia y desengrasada

Tomar una asada de un cultivo puro y hacer una suspensión turbia

Hacer una extensión y dejar secar

Fijación química de la muestra

Colocar gotas de formol hasta que cubra la muestra en el portaobjeto y dejar a temperatura ambiente, sin calentamiento al mechero, hasta su secado.(aprox 5 minutos)

Coloración

Añadir unas, hasta cubrir la muestra con el colorante de Leifson y dejar reposar por 15 minutos

Lavar la lámina con agua hasta la eliminación completa del exceso de colorante. (aproximadamente, 10 minutos)

Dejar secar al aire, y hacer la observación al microscopio óptico bajo inmersión en aceite

Los cuerpos bacterianos y los flagelos aparecieron de color rojo oscuro o azul-negro

El ácido tánico actúa como un mordiente reteniendo el colorante fucsina básica y algunos grupos funcionales de la flagelina, lo que permite un engrosamiento de los flagelos, permitiendo la observación al microscopio óptico compuesto.

Por otra parte, el formol, deshidrata a la célula; una vez deshidratada la estructura bacteriana queda fijada a la superficie del portaobjetos.

Extensión de la muestra

Colocar una gota de agua destilada en una lámina portaobjeto limpia y desengrasada

Tomar una asada del cultivo bacteriano y hacer una suspensión

Realizar el extendido de la muestra

Fijación de la muestra

Dejar secar a temperatura ambiente

Coloración

Colorear con azul de metileno de Loeffler por 3-5 minutos

Lavar con agua y dejar secar a temperatura ambiente

Observar al microscopio con el objetivo de inmersión

Los corpúsculos metacromáticos se observan de color azul o violeta, los bacilos se observa en forma de “letras chinas”, “cercas” o en V

Los corpúsculos metacromáticos son gránulos de reserva, muchas bacterias acumulan en su protoplasma grandes reservas de fosfato insolubles en agua que se tiñen con colorantes básicos

Estos corpúsculos metacromáticos o volutina aparecen como gránulos retráctiles, cuando se observan al microscopio sin teñir. Con el colorante de Azul de Loeffler u otros tintes, derivados a partir del azul de metileno se tornan de color violáceo o ligeramente rojo violáceo.

Colocar en una lámina portaobjetos una pequeña suspensión de cultivo bacteriano

Con otro portaobjetos, extender suavemente la suspensión tratando de que se obtenga un extendido sumamente fino. “squash”

Fijar la muestra (Dejar secar a temperatura ambiente

Sumergir la lámina preparada anteriormente, en el líquido de Bouin por 1 minuto

Lavar con alcohol y agua hasta eliminar la coloración amarilla del ácido pícrico

Sumergir la lámina anterior en solución de ácido tánico al 10%, por 20 minutos. Lavar con agua.

Colorear con la solución de cristal violeta por 10 segundos.

Lavar y secar a temperatura ambiente.
Observar con objetivo de inmersión

La pared celular se observa de color azul sobre un fondo amarillento.

Muestra

Bacillus licheniformis

Coloración

Rabinow

Observación

seco

Objetivo

100x

Aumento

1000

El liquido de Bouin funciona como un fijador de colorante, al eliminar el ac pírico se esta eliminando el agente químico oxidante y el ac tánico actua como mordiente reteniendo el colorante

Colocar en una lámina portaobjetos una pequeña suspensión de cultivo bacteriano

Con otro portaobjetos, presionar suavemente el cultivo y extender a fin de obtener un preparado sumamente fino

Someter a la acción de vapores de éter caliente por 5 minutos

Sumergir la preparación en el líquido de Bouin por 10 minutos

Colorear con azul de victoria al 0.02% por 30 segundos. Lavar y secar.

Observar con objetivo de inmersión

La membrana citoplasmática se observa retraída de la pared celular y está coloreada de azul, la pared celular se observa celeste

Muestra

Bacillus licheniformis

Coloración

Rabinow

Observación

Seco

Objetivo

100x

Aumento

1000

El solvente orgánico va a disolver los lípidos , este a su vez se solubiliza y permite que parcialmente la membrana se despenda porque pierde su estructura original e ingresa el colorante y colorea la membrana

Colocar en una lámina portaobjetos una suspensión de cultivo bacteriano.

Con otro portaobjetos, extender suavemente la suspensión tratando de que se obtenga un extendido sumamente fino.

Sumergir la preparación en metanol por 5 minutos. Escurrir y secar.

Sumergir en el reactivo de Schaudinn caliente durante 5 minutos.

Conservar en alcohol de 70 º por 30 segundos

Tratar por 10 minutos con HCl 1N a 60°C. Lavar con agua corriente.

Sumergir en una solución tamponada del colorante Giemsa y dejar por 10 minutos. Lavar con agua y secar.

Observar con objetivo de inmersión

El material nuclear se observa de color azul, el citoplasma incoloro y el contorno del bacilo delineado en azul

Muestra

Bacillus licheniformis

Observación

seco

Objetivo

100x

Aumento

1000

El reactivo de schaudinn sirve como fijador entre sus componentes esta el ac.acetico glacial que se usa el 1% como fijador nuclear, pero no conserva bien el citoplasma