Digital PCR como herramienta para la persistencia del VIH

Diferentes Plataformas Digitales de PCR digital

Biomark

Detección en tiempo real y punto final

Puede detectar hasta 3 colorantes fluoresentes por ensayo

"Proporciona una amplia gama de matrices de circuitos fluídicos integrados (IFC) digitales especializados donde la muestra se dispensa en un pocillo y se distribuye en múltiples cámaras de reacción individuales." (Sofie Rutsaert ,Kobus Bosman ,Wim Trypsteen ,Monique Nijhuis y Linos Vandekerckhove, 2018)

Tipo: Matrices de circuitos fluídicos integrados (IFCS)

QuantStudio™ 3D

2 canales de detección

Detección en punto final

"Emplea un chip de silicio compuesto por una matriz única de pocillos de reacción individuales sobre los que se dispensa la muestra." (Sofie Rutsaert ,Kobus Bosman ,Wim Trypsteen ,Monique Nijhuis y Linos Vandekerckhove, 2018)

Tipo: Chip

CONSTELLATION® DPCR

Detección en punto final

5 longitudes de onda de sonda por muestra

"Utiliza una microplaca donde los canales de conexión se aíslan en cámaras microfluídicas individuales mediante un rodillo de compresión de sellos." (Sofie Rutsaert ,Kobus Bosman ,Wim Trypsteen ,Monique Nijhuis y Linos Vandekerckhove, 2018)

Tipo: Cámaras microfluídicas

QX200™ Droplet Digital™ PCR y RainDrop plus™

Detección en punto final

Tipo: Gotas de tamaño nanométrico & Tipo: Gotas de tamaño pico.

"Utilizan la química de emulsión de agua en aceite para crear particiones. El generador de gotas utiliza microfluídica para crear una presión que atrae las fases acuosa y oleosa hacia el canal de salida, formando las gotas en el proceso y cada gota se lee individualmente en un lector de gotas especializado." (Sofie Rutsaert ,Kobus Bosman ,Wim Trypsteen ,Monique Nijhuis y Linos Vandekerckhove, 2018)

Ambos cuentan con 2 canales de detección.

Naica

Detección en punto final.

Detección de 3 colores (FAM/VIC/Cy5)

"Combina los métodos de matriz y emulsión. En este sistema, una muestra pasa por los canales de un chip y se generan gotas en su interior." (Sofie Rutsaert ,Kobus Bosman ,Wim Trypsteen ,Monique Nijhuis y Linos Vandekerckhove, 2018)

Tipo: Gotas de cristal en una matriz

¿Que es el PCR (Reaccion en cadena de la polimerasa)?

Es un método para cuantificar la cantidad de ADN o ARN en una muestra. En el VIH cuantifica el ADN del VIH y el ARN asociado.

Puede ser

Tiempo real

Se hace una detección en tiempo real.

Se usa una curva estándar para cuantificar el ADN O ARN.

Digital

Se hace una cuantificación absoluta.

Divide una muestra en múltiples particiones.

Modo de detección normalmente es en el punto final pero algunas también detectan en tiempo real

Elaborado por: Nicolas Cruz Herrera. Psicología 1er Semestre.
Neurobiología
Universidad Manuela Beltrán

Aplicabilidad y perspectivas futuras

Se espera que en el futuro la ddPCR permita no solo cuantificar la información sino analizar en ella misma el sitio de integración del VIH o la producción de proteínas virales pero se necesitaría un clasificador de fluorescencia integrado en el lector QX200

La ddPCR puede ayudar a mejorar la comprensión de la brecha entre el crecimiento viral o determinar el número de veces que se ha expandido una secuencia del VIH.

"La PCR digital ha demostrado ser una nueva tecnología valiosa y con mejoras adicionales en perspectiva es probable que se convierta en una herramienta indispensable en la futura investigación sobre el VIH." (Sofie Rutsaert ,Kobus Bosman ,Wim Trypsteen ,Monique Nijhuis y Linos Vandekerckhove, 2018)

Desafíos y ventajas de la PCR digital de gotas (QX200)

Desafíos

Determinación del umbral

Determinar el umbral correcto para definir positivo y negativo ya que al ser muchas veces automático puede ser muy estricto lo cual clasifique incorrectamente las gotas.

Gotas intermedias

Dichas gotas (Rain) tienen una fluorescencia intermedia lo cual hace difícil clasificarlas

Falsos positivos

Aunque no está claro el origen, pueden surgir por contaminaciones de las muestras o gotas que se fusionan y dan una fluorescencia basal más alta que se puede considerar positiva.

Falta de un clasificador de intensidad de fluorescencia que permita la confirmación del objetivo en caso gotas intermedias para su clasificación correcta.

Ventajas

Superioridad a la qPCR por su cuantificación absoluta directa

Elimina la necesidad de una curva estándar en el caso de cuantificaciones de ADN y las comparaciones de cuantificaciones de ARN

Mayor precisión y reproducibilidad

La ddPCR permite mayor distribución de una muestra en múltiples particiones

Permiten análisis de múltiples muestras en un solo ensayo.