Enzimología

Proteínas catalíticas

Proteínas globulares (en su mayoría) que unen ligandos y facilitan si transformación en otra molécula de interés.

Catalizan

Formación, rotura y rearreglo de los enlaces covalentes para formar nuevas moléculas como:

Proteínas

Ácidos nucleicos

Lípidos

Carbohidratos

Oxidorreductasas

Catalizan reacciones redox, que en el medio biológico tienen lugar a través de la transferencia de electrones.

Transferasas

Transfieren grupos moleculares de una molécula donadora a una aceptora. Entre tales grupos están el amino, el carboxilo, metilo, fosforito y acilo.

Hidrolasas

Catalizan reacciones en las que se produce la ruptura de enlaces como C-O, C-N y O-P por la adición de agua (hidrólisis).

Ejemplos: Esterasas, fosfatasas y peptidasas.

Liasas

Catalizan reacciones en las que se eliminan grupos para formar un doble enlace o se añade a un doble enlace.

Isomerasas

Grupo heterogéneo de enzimas, catalizan varios tipos de reordenamientos moleculares.

Ligasas

Catalizan la formación de enlaces entre dos moléculas de sustrato.

Ejemplo: La ligada de DNA une entre sí fragmentos de cadenas de DNA

Nombre recomendado

Nombre corto por el cual se le conoce coloquialmente a una proteína.

Sufijo "asa"

Unido al nombre del substrato de la reacción que cataliza.

Ejemplos

Arginasa: Cataliza la hidrólisis de la arginina a la ornitina y urea.

Fosfatasa: Cataliza la hidrólisis de los ésteres fosfóricos

Se utiliza para la descripción de la reacción que cataliza la enzima.

Ejemplos

Lactado Deshidrogenasa (LDH): Le “quita” hidrógenos al lactato.

Adenilato Ciclasa: Hace un ciclo en la adenina.

Nombre sistemático

Infiere propiedades sobre la reacción desarrollada por la enzima. Además, permite reconocerla sin ambigüedad y puede ser localizada en el metabolismo. Estos nombres son designados por la Enzyme Comission (EC).

Se dividida en seis grupos y subgrupos y se le asigna un código de cuatro dígitos con un significado.

Número 1: Indica grupo principal.

Número 2: Indica el subgrupo.

Número 3: Indica un subsubgrupo.

Número 4: Indica el orden en el que fue descubierto.

Autorregulación

Para inhibición por retroalimentación

Para la degradación de enzimas

En la modificación postranscripcional

Son proteínas que poseen un efecto catalizador al reducir la barrera energética de ciertas reacciones químicas

Por ejemplo

Catalizan reacciones de las rutas metabólicas centrales

Influyen solo en la velocidad de la reacción sin alterar el estado de equilibrio

Haciendo que

Aumentan la velocidad de reacción de 10^5 y 10^7

Actúan en pequeñas cantidades y forman un complejo reversible del sustrato.

A su vez

Teniendo factores que incluyen en su función

Un pH neutro

Concentración

Temperaturas menores a 100°C

No se consumen en la reacción, pudiendo actuar una y otra vez

Muestran especificidad por el sustrato y su producción está directamente controlada por genes

Estreospecifidad

Reacciona con algunos isómeros ópticos

Complementariedad

Geométrica

Electrónica

Emil Sischer

Se estipula que las enzimas y sustratos presentan interacciones específicas y complementarias

Daniel Koshland

Estipula que las enzimas son dinámicas y presentan cambios conformacionales que les permiten mejor adherencia al sustrato.

Modelo aceptado

Tipos de catálisis

Catálisis covalente

Nucleófilo que se modifica covalentemente de forma temporal

Formación de enlace covalente transitorio entre la enzima y el sustrato

Catálisis Ácido-Base

Se debe a la transferencia de un protón

Transferidos desde el sustrato o el intermediario

El intermediario se convierte en una especie fácil de descomponer productos.

Catálisis por ion metálico

Generalmente se utiliza en cationes

Se puede llevar a cabo de maneras diferentes orientando el sustrato de la forma adecuada para reaccionar

Catálisis por aproximación

Sirve para que las moléculas en las reacciones deban aproximarse entre sí a la distancia de formación de enlace.

Cuerpo humano

Enzimas

Isomerasas

Catalizan la inter-conversión de isómeros

Liasas

Catalizan la reacciones de ruptura y/o soldadura de sustratos

Hidrolasas

Catalizan las reacciones de hidrólisis (adición de agua)

Transferasas

Catalizan la transferencia de un grupo químico de un sustrato a otro

Oxidorreductasas

Catalizan reacciones de redox, es decir, transferencia de hidrógeno o electrones de un sustrato a otro.

Vida cotidiana

Ejemplo: proteasas, amilasas y/o lipasas

Usos: Detergentes

Industria alimenticia

Área

Panificación

Ejemplos: amilasa, proteasas, lipoxidasa, lactasa

Usos:
-Mejorar la calidad del pan
-Disminuye la viscosidad
-Produce un miga muy blanca

Cámicos

Ejemplos: papaína, fascina, bromelina

Usos:
-Ablandamiento de carnes
-Producción de hidrolizados

Lácteos

Ejemplos: Tripsina, lactasa

Usos:
-Enmascara el gusto a óxido
-Producción de hidrolizados

Basados en el tamaño molecular

Tamizaje general

-Ruptura celular
-Ultracentrifugación
-Centrifugación diferencial o en gradiente
-Partículas "bio-magnéticas"

Diálisis

Separa las proteínas del solvente valiéndose del gran tamaño de las proteínas frente al de moléculas de sales y del solvente

La muestra se introduce en una bolsa o tubo de membrana semipermeable y se cierran ambos extremos. La proteína no pasa la membrana semipermeable.

Se retienen las proteínas de gran tamaño dentro de la bolsa de membrana

Cromatográficos

En columna

-Más potente para el fraccionamiento de mezclas proteicas
-Fase estacionaria (sólido poroso) y fase móvil (solución que lentamente atraviesa la fase estacionaria)
-Conforme migran las proteínas por la columna, su avance puede ser retardado en diferente grado por sus interacciones con la fase estacionaria

De intercambio iónico

-A un pH determinado
-Se basa en diferencias de signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas
-Matriz de columna: polímero sintético que contiene unidos grupos cargados

De Afinidad

-Por afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando
-Se retienen las proteínas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna
-La proteína de interés retenida se eluye (se libera) con una solución que rompa la interacción ligando-proteína
-El pH influye en la afinidad de la proteína porque determina su estado de ionización
-Afinidad influenciada por concentración de iones en solución (concentración salina)

De exclusión molecular

-De filtración en gel
-Separación en función de tamaño
-Matriz de columna: polímero entrecruzado con poros de tamaño determinado
-Proteínas de mayor tamaño migran por la columna más rápido que las de menor tamaño

Automatizados

HPLC

-Cromatografía líquida de alta eficacia
-Se hace pasar una mezcla en un sistema disolvente (fase móvil) por acción de una bomba
-La fase móvil pasa a través de una columna cromatográfica que contiene la fase estacionaria

Electroforéticos

Se basa en la migración de iones en un campo eléctrico. La migración depende de: carga de la molécula, campo eléctrico, tamaño, forma, estado de solvatación y viscosidad de la solución. Se involucran la fuerza eléctrica y de fricción.

En papel

-Muestra sobre tira de papel filtro, con extremos sumergidos en recipientes con amortiguador a los que se conectan electrodos
-Iones migran al electrodo de carga opuesta
-Puede ser combinada con cromatografía de papel

En gel

-Geles de agarosa y poliacrilamida
-Basada en la filtración del gel y las movilidades electroforéticas de las moléculas
-En gel de poliacrilamida (PAGE): Acrilamida, bisacrilamida y buffer a elección
-pH cercano a 9 para proteínas
-En gel de agarosa: Separación de macromoléculas de gran tamaño, como ADN y ARN
-Bandas correspondientes a proteínas detectadas por tinción, marcación radioactiva o detección de anticuerpos
-Para proteínas se emplea tinción con azul de Coomassie; compuestos fluorescentes y nitrato de plata para cantidades pequeñas

SDS-PAGE

-SDS (dodecil sulfato de sodio) es un detergente que desnaturaliza fuertemente a las proteínas. Tiene carga negativa y es capaz de rodear una proteína completamente enmascarando su carga (idéntica relación de masa-carga y similar forma
-Separación de acuerdo a peso molecular

Capilar

-En delgados capilares
-Muy efectivo, pero requiere de muchas horas
-Difícil cuantificación y automatización
-Uso limitado a pequeñas cantidades y análisis

Secuenciación

Método de Edmann

-El amino residuo terminal se etiqueta y retira del péptido sin afectar los enlaces de los otros residuos

Espectrometría de masas

Técnica MALDI-TOFF

-Desorción/ionización láser asistida por matriz
-Análisis de biomoléculas (proteínas, péptidos, azúcares y lípidos) y moléculas orgánicas grandes (polímeros, dendrímeros y otras macromoléculas)

Mutagénesis y expresión en sistemas biológicos

Mutagénesis sitio-dirigida

Expresión en sistemas biológicos

Se rige por tres mecanismos

1.- Modificaciones postraduccionales

Consiste en glicosilaciones, adición de grupos lipídicos, etc.

Tipos de regulación enzimática

Enzimas alostéricas

Responsable de las alteraciones en el estado metabólico.

Modificaciones covalentes

Es capaz de activar enzimas e inactivas otras

Síntesis de zimógenos

Su conversión implica una proteólisis selectiva

Síntesis de isoenzimas

Aportan una vía de regulación de un misma reacción en diversas localizaciones o tiempo.

2.- Diferenciación celular

Permite que sea posible la vida en general.

3.- Transcripción

Es el principal método a través de inductores que son sustratos para la enzima

Importancia

-Mecanismos de control en los organismos vivos. -Mecanismo de acción de varios fármacos y tóxicos. -Conocer el mecanismo de acción de las enzimas determinando residuos de aminoácidos importantes para la catálisis.

Inhibición Reversible

Competitiva

-Las estructuras de estos inhibidores se asemejan a las del sustrato
-Los efectos se superan al aumentar concentración de sustrato
-El inhibidor se une al sitio activo de la enzima
-Disminuye moléculas libres y evita formación de complejo enzima-sustrato

No competitiva

-Es factible la formación de complejos enzima-inhibidor y enzima-inhibidor-sustrato
-Se disminuye la eficiencia para formar producto a partir del complejo EIS
-Afecta afinidad aparente de la enzima por el sustrato

Inhibición Irreversible

Inhibidores Suicidas (basados en mecanismo)

Contienen un grupo químico que puede transformarse mediante la maquinaria catalítica de la enzima blanco

Modificación química de la enzima

Complejo enzima-inhibidor muy estable

El inhibidor se une de manera covalente a la enzima y bloquea su función

Inhibidores útiles para identificar residuos de aminoácidos del sitio activo

Promisorios para la creación de fármacos específicos para enzima

EJEMPLOS:
-Deprenilo: Para tratar mal de Parkinson
-Penicilina: Betalactámico empleado para el tratamiento de infecciones provocadas por bacterias sensibles

FÁRMACOS

Muchos actúan como inhibidores de enzimas

Las enzimas son blancos naturales para la creación de fármacos potentes y específicos

Fármacos estatina:
Inhiben la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa, disminuyendo así la producción de colesterol
Farmacoterapia de hipertensión:
Inhibidor de enzima convertidora de angiotensina, disminuyendo la concentración de angiotensina II, un vasoconstrictor

Se expresa por unidades internacionales (UI). Es la cantidad de enzima que produce un umol de producto por minuto a 25°C en condiciones estándar

Afectada por:

Concentración sustrato

-Si la enzima no se enlaza con el sustrato no ejerce actividad enzimática
-Mayor concentración, mayor velocidad de reacción
-Más moléculas de sustrato, mayor probabilidad de unirse al sitio activo de la enzima
-A partir de la Vmax la concentración de sustrato no aumenta la velocidad

Concentración enzima

-Mayor concentración, mayor velocidad de la reacción
-Valor de Km independiente de la concentración enzimática

Temperatura

-A mayor temperatura las reacciones se aceleran, aumento de 1°C aumento de 10% de actividad enzimática
-Colisiones más frecuentes del sustrato con la enzima
-El incremento de la temperatura (40-50°C) provoca la desnaturalización de la enzima y pérdida de la actividad catalítica
-Rango de temperatura óptimo similar al del medio fisiológico en que trabajan las enzimas

pH

-Cambio de ionización de enzima o sustrato
-Ionización de los grupos aminados del sitio activo o cercanos a él puede provocar cierto grado de desnaturalización de la enzima
-Enzimas con significado clínico: la mayoría con actividad óptima a pH neutro
-Para determinar actividad enzimática se emplean sustancias amortiguadoras en la mezcla de la reacción

Activadores

-Incrementan velocidad de reacción
-Moléculas o iones pequeños: Zn, Mg, Fe, Mn
-Sitio activo electropositivo que atrae grupos con carga negativa del sustrato
-Estabilizar estructura terciaria y cuaternaria de la enzima
-Coenzimas similares a activadores: se requieren para actividad enzimática completa
-Se requiere coenzima en concentración suficiente

Inhibidores

-Inhiben selectivamente la acción de determinadas enzimas
-Se enlazan en diferentes sitios de la molécula enzimática
-Variación de velocidad de reacción
-Competitivos y No competitivos