DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA POR EL MÉTODO DE LA
CIANOMETAHEMOGLOBINA

EL MÉTODO DE CIANOMETAHEMOGLOBINA

FUNDAMENTO.

Para convertir la Hb-O2 en Hb-CN se utiliza el Reactivo de Drabkin, el cual contiene ferricianuro de potasio K3Fe (CN)6 que convierte el Fe++ en Fe+++ convirtiéndose en metahemoglobina. Luego el KCN del mismo reactivo se combina para formar la Cianometahemoglobina, cuyo pico máximo de absorción es de 540nm con un rango de 530 a 550 nm.

PROCEDIMIENTO

1) Se marcan 2 tubos de ensayo, uno como blanco (B) y otro como problema (P) y se colocan 5 ml. del Reactivo de Drabkin en cada uno.

2) Con la pipeta de Shali, se toma 0.02 ml (20l) de sangre limpiando perfectamente la pipeta por fuera con un segmento de papel desechable humedecido con solución salina, se pasan al tubo, lavando la pipeta 2 o 3 veces, por aspiración y expulsión del reactivo dentro de la misma.

3) Se mezcla vigorosamente con cuidado. Dejar reposar la mezcla por 5 minutos. Pasar a las celdas.

4) Ajustar el espectrofotómetro a cero de absorbancia con el blanco de reactivo (B) a 540 nm. y se lee la absorbancia del tubo problema.

5) Calcular la concentración de la Hemoglobina, a partir de la Ley de Beer o bien extrapolar en la curva de calibración

CURVA DE CALIBRACIÓN

a) Marca 5 tubos de ensaye de 13x100 mm: Blanco (B), 5, 10, 15, 20 g/dl

b) Pipetear con precisión, de la solución valorada de Cianometahemoglobina (St) de concentración de 20 g/dl y del Reactivo de Drabkin, en cada uno de los tubos correspondientes y mezclar bien.

c) Medir la absorbancia de cada dilución en el espectrofotómetro a 540 nm, contra el blanco (B).

d) Graficar en papel milimétrico, en las ordenadas (Y) las absorbancias y en las abscisas (X) las concentraciones.

e) Trazar una línea perpendicular que parta del vértice (O) y toque el mayor número de puntos.

f) Extrapola las absorbancias de las muestras problema.

VALORES DE REFERENCIA

A. HOMBRES 15 a 20 g/dl 9.3 a 12.4 mmol/l

B. MUJERES 12.5 a 16.5 g/dl 7.5 a 10.33 mmol/l