PCR Digital Como Herramienta para Medir la
Persistencia del VIH
Rutsaert, S. at al. (2018) Digital PCR as a tool to measure HIV
persistence. Retrovirology.
Ventajas.
La PCR digital produce una
cuantificación absoluta directa.
Los resultados absolutos de la cuantificación producidos por la PCR digital eliminan la necesidad de una curva estándar en el caso de cuantificaciones de ADN y comparaciones de cuantificaciones de ARN.
La cuantificación precisa mediante qPCR se basa en la calidad de la curva estándar.
La inestabilidad de la curva estándar puede provocar una cuantificación inexacta del ADN del VIH.
En experimentos de PCR digital dúplex en objetivos vinculados, se observó una minoría de particiones en las que solo uno de dos ensayos demostró amplificación.
En caso de una verdadera falla en la amplificación, actualmente no está claro si este modo potencial de subestimación del objetivo se refiere únicamente a la PCR digital o si existen mecanismos similares en juego en el caso de (q) PCR.
Falsos positivos.
Independientemente del método que se utilice para asignar un umbral, las plataformas de PCR digitales disponibles actualmente sufren la observación de particiones falsas
positivas y, por lo tanto, resultados falsos positivos.
Pueden surgir de:
Contaminaciones.
Gotitas alteradas que se fusionan.
Su fluorescencia conjunta da lugar a una gotita con una fluorescencia inicial más alta que se denomina erróneamente positiva.
AlloSCT es actualmente el único método conocido mediante el cual se puede reducir drásticamente el reservorio del VIH.
Uno de cada tres pocillos de controles negativos sin plantilla tenía 2 o 3 gotitas positivas (0,16–0,22 copias/reacción) para el ensayo de ARN del VIH-1 descrito por Kiselinova et al.
Estas gotitas tenían un nivel de fluorescencia similar al de las gotitas positivas en las muestras de pacientes.
Pueden suponer una amenaza para la cuantificación fiable del ADN del VIH en entornos con bajas concentraciones de ADN del VIH.
Transmisión de madre a hijo.
Transmisión temprana al inicio del tratamiento.
Alotrasplante de células madre (aloSCT).
Después de un trasplante exitoso de células madre, los pacientes siguen recibiendo tratamiento antirretroviral y se les monitorean los niveles de ADN del VIH.
Determinación del umbral.
Determinar un umbral correcto es crucial para una cuantificación confiable.
En ddPCR, las gotitas generadas se identifican como positivas o negativas según un umbral en un determinado nivel de fluorescencia.
Se utiliza para calcular la abundancia objetivo mediante estadísticas de Poisson.
Software QuantaSoft
Ofrece
Lluvia
Definir un umbral se complica por las gotas con una fluorescencia intermedia.
Su población positiva o negativa es complicada.
Separación entre gotas positivas y negativas
Puede depender de
Enfoques
Métodos de agrupamiento
Strain et al.
Mediana y la varianza de las nubes negativas y positivas para evaluar la probabilidad estadística de que se incluyan valores atípicos en cualquiera de las nubes.
Jones et al.
Desarrolló "definetherain" que utiliza muestras decontrol positivas y negativas para identificar las dos nubes.
Método de determinación de umbral único
Dreo et al.
Las gotas con intensidad de fluorescencia intermedia pueden contener gotas positivas verdaderas.
Se define como la señal de fluorescencia media en los NTC (sin controles de plantilla) más un número de desviaciones estándar hasta que quede una gota positiva en los NTC.
Método de umbral
Trypsteen et al.
Asigna un umbral independientemente de los muchos factores que pueden afectar la intensidad y distribución de la fluorescencia de las gotas.
Alimenta datos de controles negativos a un modelo de valor extremo generalizado y aplica este umbral a las muestras.
Lievens et al.
Determinan el umbral en función de la forma de los picos de densidad de fluorescencia, pero para tener en cuenta la posibilidad de que las nubes no estén distribuidas normalmente, establezca el umbral por encima del límite superior de la nube negativa.
Diana Marcela Parra Contreras
Profesor Juan Bravo
Corte V12
Neurobiología
Universidad Manuela Beltrán
Plataformas PCR digitales.
Biomarca
Compañía: Fluidigm™
Circuitos fluídicos integrados
(IFCS) matrices.
Detección tiempo real y punto final.
Software: Análisis de PCR digital.
Detección de hasta 3 colorantes fluorescentes por ensayo.
QuantStudio™ 3D
Compañía: Applied Biosystems/Life technologies™
Chip.
Detección punto final.
Software: QuantStudio™ 3D Analy- sisSuite™.
2 canales de detección (FAM/VIC).
Naica
Compañía: Stilla Technologies
Gotas de cristal en una matriz.
Detección punto final.
Software: Crystal Miner.
Detección de 3 colores (FAM/VIC/Cy5).
RainDrop plus™
Compañía: RainDance™ Technologies
Gotitas de tamaño picoso.
Detección punto final.
Software: RainDrop Analyst II™.
2 canales de detección (FAM/VIC).
QX200™ Droplet Digital™ PCR
Compañía: Bio-Rad
Gotitas de tamaño nanométrico.
Detección punto final.
Software: QuantaSoft™.
2 canales de detección (FAM/VIC).
CONSTELLATION® DPCR
Compañía: Formulatrix
Cámaras de microfluidos.
Detección punto final.
Software: CONSTELLATION®.
5 longitudes de onda de sonda por muestra.
Desafíos y beneficios de la PCR digital en gotas.
QX200 es la plataforma de PCR digital más utilizada.
Aplicabilidad y perspectivas de futuro.
Medición del reservorio del VIH mediante PCR digital.
Utilizado para medir los efectos del inicio temprano del tratamiento.
Vacunación terapéutica.
Trasplante alogénico de células madre.
Interrupciones estructuradas del tratamiento.
Inmunización mediante anticuerpos ampliamente neutralizantes.
Agentes reversores de latencia (LRA).
Aunque la PCR digital permite la cuantificación precisa del ADN y ARN del VIH en pacientes, no permite a los investigadores obtener información sobre la competencia de replicación del reservorio.
El sistema Naica de Stilla permite actualmente la inspección visual del tamaño y la geometría de una gota de un solo cristal y la exclusión de aquellas que son aberrantes.
La ddPCR multiplexada puede mejorar nuestra comprensión de la brecha entre el crecimiento viral y los ensayos basados en PCR.
La ddPCR multiplexada podría ayudar a determinar el número de veces que se reproduce una secuencia del VIH.
Método no revelado para la asignación automática de umbrales.