PCR Digital y la Persistencia del VIH
1. Antecedentes y Problemas
Persistencia del VIH como ADN proviral en células CD4+ T latentes a pesar del tratamiento antirretroviral (TARGA)
Rebote Viral si se interrumpe el TARGA
Es crucial cuantificar para encontrar una cura
La PCR en tiempo real (qPCR) ha sido la herramienta estándar para medir el reservorio viral (ADN y ARN del VIH)
2. Principios de la PCR Digital (dPCR)
La PCR digital (dPCR) emerge como una estrategia para la cuantificación de ácidos nucleicos
Tecnología valiosa e indispensable en la investigación del VIH
Divide la muestra aleatoriamente en múltiples particiones
Las particiones con la molécula diana emiten fluorescencia
Umbral para distinguir particiones positivas y negativas
El concepto se aplicó inicialmente para detectar objetivos raros
Aplicación en VIH, se combinó PCR con dilución límite para cuantificar provirus
La dPCR es ahora una herramienta de cuantificación ampliamente aceptada
3. Plataformas de PCR Digital
Distribución de la muestra en múltiples particiones
Métodos de Particionamiento (manual y automatizado)
Plataformas Automatizadas
Basadas en Arrays
Basadas en Emulsión (gotas)
Combinación
QX200 ddPCR, la plataforma más utilizada en la investigación del VIH
4.Ventajas de la PCR Digital sobre qPCR
No requiere curva estándar para cuantificar ADN
Las pequeñas diferencias entre primers/sonda y el VIH heterogéneo no afectan la cuantificación si la fluorescencia final supera el umbral
Mayor Robustez y menos susceptible a inhibidores y a la reducción de la eficiencia de amplificación
Mayor Precisión y Reproducibilidad para medir efectos en el reservorio del VIH
5. Desafíos de la PCR Digital
Determinación del Umbral: Crítica para la cuantificación fiable; la presencia de gotas con fluorescencia intermedia ("rain") complica la asignación
Falsos positivos, en las plataformas actuales incluyendo QX200
sensibilidad de qPCR en ciertos casos
PCR Dúplex, casos de amplificación de un solo objetivo con causas no claras
6. Aplicaciones y Perspectivas Futuras
Medición del Reservorio en Estudios: Evaluación de terapias tempranas, vacunas terapéuticas, trasplantes, interrupciones de tratamiento, anticuerpos neutralizantes, agentes reactivadores de la latencia (LRA) y otros agentes
Avances deseados
Sistemas multiplex de mayor capacidad
Análisis de datos y configuración de umbrales
Control de calidad de las particiones
Gotas unicelulares para estudiar dinámicas de latencia
PCR Digital Multiplexada que ayudaría a comprender la diferencia entre ensayos de crecimiento viral y PCR, y estudiar la expansión clonal