Principios y aplicaciones
de la microscopia láser confocal
en la investigación biomédica
Introducción
El desarrollo de la microscopia confocal surgió hace
más de 50 años con la generación de un primer
aparato diseñado por Marvin L. Minky en 1957.
Microscopia de fluorescencia
La microscopia de fluorescencia convencional es
aquella que utiliza una fuente de luz, generalmente
una lámpara de mercurio, xenón o diodos emisores
de luz (LEDs) para excitar los electrones de moléculas fluorescentes contenidos en una muestra.
La microscopia confocal hace uso de la
fluorescencia convencional, pero introduce el principio
de confocalidad, que se refiere a la colimación de un
punto de luz en un plano particular de una muestra.
El resultado permite visualizar estructuras microscópicas, naturalmente fluorescentes o premarcadas con diversos fluorocromos en células y tejidos de plantas o animales.5-7 Por lo general, las muestras biológicas, especialmente de tejido, tienen un grosor en el rango de las decenas de micrómetros.
Principio del sistema
de microscopia confocal
Los microscopios confocales requiren:
Fuente de luz con varios láser con emisiones distintas que incluyan:
Argón
458, 476, 488, 496 y 514 nm
Helio-neón
543 nm y 633 nm
Diodo azul
405 nm
Filtros ópticos de excitación que permitan:
El paso de los rangos de longitud de onda que se ajusten al espectro de los fluorocromos que se desea excitar
Filtros de barrera que den el paso:
Fluorescencia emitida en la longitud de onda que se desea detectar eliminando otras no deseadas
El observador puede ver sola una región de 500 nanómetros de profundidad del tejido en el rango de las decenas de micras.
Es usado en el campo de biomedicina para determinar la colocalización estructural de elementos celulares
Permite realizar varios cortes ópticos finos en muestras gruesas y además efectuar reconstrucciones tridimensionales a partir de varios cortes ópticos continuos.
La imagen resultante contiene tres dimensiones (3D), donde el software permite girar la imagen 3D y obtener información adicional de la muestra
Se manejan a través de una computadora y un programa especializado.
Las imágenes no pueden observarse a través de los oculares, sino que se despliegan en el monitor de una computadora.
Aplicaciones de la microscopia confocal
Algunas de las aplicaciones de la microscopia
confocal en la investigación en biomedicina:
Análisis de colocalización de biomoléculas
membranales o intracelulares
Cambios en la expresión y distribución de moléculas en organelos
Análisis 3D de componentes y organelos celulares
En el área de la dermatología, se utiliza en el estudio de:
Queratosis seborreica
Angioma
Queratosis actínica
Melanoma maligno
Psoriasis
Pénfigo vulgar
En el área oftalmológica, se usa como:
Herramienta diagnóstica de infecciones de la córnea
En la evaluación de la vasculatura del limbo, la conjuntiva, la homeostasis celular ocular, la degeneración macular
Permite la visualización in vivo, en tiempo real y con alta resolución de las delgadas capas de los tejidos del globo ocular
En el área oncológica:
Ayuda a identificar y determinar el espaciamiento de neovasos
Permeabilidad celular
Anormalidades estructurales que se presentan durante la progresión tumoral
Conclusiones
El microscopio confocal es una herramienta ampliamente utilizado en la investigación biomédica y varias aplicaciones, incluyen la capacidad
realizar análisis desde el nivel de la estructura del tejido a la molécula. Esta técnica proporciona la fusión como técnica de arte moderno al alcance de nuestra comunidad, la biomedicina fortalece la asociación con investigación clínica.
Transferencia de energía
por resonancia fluorescente (FRET)
Se utiliza para determinar la proximidad entre
dos moléculas marcadas dentro de la célula o en un
mismo microambiente.
El principio de FRET se basa en la presencia de dos moléculas fluorescentes: un donante y un receptor.
Para que la transferencia de energía ocurra, el espectro de absorción del fluoróforo receptor debe
traslapar al de emisión de fluorescencia del donador
y la distancia entre las dos moléculas debe oscilar
entre 1-10 nm.
La técnica de FRET es una herramienta para el estudio y cuantificación de las interacciones en transducción de señales, la síntesis de complejos
entre proteínas, la dinámica de membranas y el acoplamiento tridimensionales entre moléculas.
Recuperación de fluorescencia
por fotoblanqueo (FRAP)
Es una técnica que permite analizar la difusión y movimiento
de macromoléculas biológicas.
Por medio de blanqueo o destrucción de moléculas fluorescentes en una zona de interés de una muestra.
Los estudios de
FRAP
Requieren que la muestra no esté fijada y puede
llevarse a cabo en células o tejidos vivos marcados
con partículas fluorescentes unidas a la molécula de
interés biológico.
Los experimentos de FRAP consisten en la obtención de una serie de imágenes utilizando una intensidad baja de láser para determinar la fluorescencia inicial y luego se aplica un alto nivel de la luz durante un tiempo corto en la región de interés para destruir las moléculas fluorescentes.
Se obtienen imágenes que permitan analizar la redistribución de las moléculas a través de la recuperación de la fluorescencia en el tiempo en la región.