4/1. Как сделать самодельные среды для выращивания микроорганизмов?

Одна из наиболее широко применяемых в отечественных исследованиях сред для выращивания инфузорий рода Paramecium - среда Лозино-Лозинского.Обычно она готовится в виде концентрата 10-кратной концентрации (10x). Концентрат среды Лозина-Лозинского готовится следующим образом: в 1 литре дистиллированной воды растворяют 0,1 г NaCl, 0,01 г KCl, 0,2 г NaHCO3, 0,01 г MgSO4 х 7 H2O, 0,01 г CaCl2. Для приготовления рабочего раствора (инкубационной смеси) смешивают 1 объем концентрата с 9 объемами воды (например, 100 мл концентрата + 900 мл воды).Культура парамеций лучше всего выращивать при температуре 20-25˚C с естественной рассеянной освещенностью в течении дня или с искусственным чередованием света и темноты («день-ночь») 12 + 12 часов в течение суток.В качестве корма можно использовать множество веществ и продуктов, но одним из самых простых, доступных и легко стандартизируемых вариантов являются обычные сухие пекарские дрожжи. Активные (быстрорастворимые) дрожжи лучше, чем те, которые требуют предварительной инкубации в жидкости. Рекомендуемый режим кормления 0,07 г сухих дрожжей на культуру объемом 400-600 мл 2 раза в неделю. Перед добавлением в культуру дрожжи суспендируются в 10 мл воды для более равномерного распределения в культуре.Через каждые 1-2 недели культуру инфузорий требуется отмывать от остатков корма и продуктов метаболизма. Для этого культуру инфузорий переливают в узкогорлую колбу, которую накрывают темной тканью, оставляя открытым горлышко. Средой Лозино-Лозинского доводят до верха. Через некоторое время инфузории выплывают в верхнюю часть колбы, после чего их отбирают дозатором на 10 мл и переносят в чистый стакан, а затем снова доливают средой Лозино-Лозинского. Процедура повторяется до тех пор, пока культура не станет прозрачной. После отмывки инфузории необходимо покормить, а на сосуд с ними поставить дату последней отмывки.

Чаще всего - какие-нибудь углеводы (сахара), например, глюкоза, сахароза, целлюлоза, крахмал

Чаще всего - аминокислоты, амины, пептиды, могут быть белки, нуклеотиды

Обычно используются для создания нужного осмотического давления и ионной силы, а также как источники микроэлементов

Соединения которые необходимы микроорганизмам, но ими сами не синтезируются, например, п-аминобензойная кислота

Создают среду с нужной величиной рН и определенной буферной емкостью, чтобы в ходе выращивания не происходило закисления или защелачивания питательной среды

готовить питательные среды по готовым прописямстерилизовать питательные средыработать в асептических условиях

Какие питательные среды называют минимальными и почему?Как выбирать источники углерода и азота, подходящие для выращивания определенным микроорганизмов?Как можно только за счет подбора состава среды стимулировать рост одних микроорганизмов и подавить рост других?

В работе используются три контрольных среды (обычно используемые в лабораториях) и три опытных среды (из легко доступных компонентов).Подготовительная часть (преподаватель + лаборант): подготовка необходимых материалов и оборудования.Основная часть 1 (студенты в начале занятия): студенты делятся на подгруппы по числу приготавливаемых питательных сред (контрольных и опытных).Основная часть (лаборант, в течение занятия): стерилизация сред, приготовленных студентами.Основная часть 2 (студенты в конце занятия): студенты разливают свои твердые среды после стерилизации по стерильным чашкам Петри (2 чашки с каждой средой), а жидкие - по стерильным пробиркам (2 с каждой средой); после остывания сред - засевают чашки и пробирки микроорганизмами.Последующая часть (лаборант): инкубация чашек Петри и пробирок с питательными средами, инокулированных образцами, в термостате (25°С для грибов и 37°С для дрожжей и бактерий) с проверкой роста 2 раза в день. При достижении целевого уровня роста (числа и размера колоний или мутности; критерии определяются преподавателем с учетом возможностей лаборатории) чашки переносятся из термостата в холодильник (+4°С) и сохраняются там до дня занятия 5. За 1 час до начала занятия чашки переносятся из холодильника в термостат с соответствующей температурой.Важно! Поскольку студенты работают с разными условиями экспериментов преподавателю следует обеспечить студентам возможность ознакомиться с результатами друг друга. Делать это в ходе выполнения эксперимента или во время заключительного мини-коллоквиума занятия - выбор преподавателя.

Протокол выполнения опытаВ экспериментах как тестовые указаны бактерии Escherichia coli и Bacillus subtilis. По усмотрению преподавателя они могут быть заменены на любые другие бактерии, не являющиеся патогенными для человека, и способными расти на контрольной и опытных средах.Приготовление средыдля приготовления 100 мл среды взвесьте 1 г ферментативного гидролизата казеина (или триптона, или пептона), 0,5 г дрожжевого экстракта и 1 г NaCl;растворите NaCl в 80 мл теплой воды;в полученном солевом растворе растворите остальные компоненты среды;добавьте 1,5 г агара, суспендируйте и доведите объем смеси до 100 мл водой в мерном цилиндре;перенесите смесь в колбу и перемешивайте при нагревании на водяной бане до полного растворения агара;закройте колбу плотно ватно-марлевой пробкой;передайте колбу лаборанту для стерилизации в автоклаве.Заливка чашек Петри автоклавированной средойстерилизованную среду немного охладить (не ниже 75°С) и разлить в чашки Петри (или заменяющую их посуду) в стерильных условиях (например, в ламинарном шкафу);после остывания до комнатной температуры чашки со средой можно использовать для инокуляции микроорганизмами.Нанесение образцов на чашки для культивированияпо поверхности одной чашки Петри распределите 0,1 мл суспензии клеток Escherichia coli, предоставленную преподавателем;по поверхности другой чашки Петри распределите 0,1 мл суспензии клеток Bacillus subtilis, предоставленную преподавателем;поставьте необходимые пометки на крышках чашек Петри и закройте их;передайте чашки Петри, лаборанту для инкубации до занятия 5.

Протокол выполнения опытаВ экспериментах как тестовые указаны бактерии Escherichia coli и Bacillus subtilis. По усмотрению преподавателя они могут быть заменены на любые другие бактерии, не являющиеся патогенными для человека, и способными расти на контрольной и опытных средах.Приготовление средыдля приготовления 100 мл среды возьмите 2 чайных ложки сахара и 1 чайную ложку куриного или говяжего сухого бульона;хорошо размешайте всё в 80 мл теплой воды;добавьте 1,2 г агар-агара, суспендируйте и доведите объем смеси до 100 мл водой в мерном цилиндре;перенесите смесь в колбу и перемешивайте при нагревании на водяной бане до полного растворения агар-агара;закройте колбу плотно ватно-марлевой пробкой;передайте колбу лаборанту для стерилизации в автоклаве.Заливка чашек Петри автоклавированной средойстерилизованную среду немного охладить (не ниже 75°С) и разлить в чашки Петри (или заменяющую их посуду) в стерильных условиях (например, в ламинарном шкафу);после остывания до комнатной температуры чашки со средой можно использовать для инокуляции микроорганизмами.Нанесение образцов на чашки для культивированияпо поверхности одной чашки Петри распределите 0,1 мл суспензии клеток Escherichia coli, предоставленную преподавателем;по поверхности другой чашки Петри распределите 0,1 мл суспензии клеток Bacillus subtilis, предоставленную преподавателем;поставьте необходимые пометки на крышках чашек Петри и закройте их;передайте чашки Петри, лаборанту для инкубации до занятия 5.

Протокол выполнения опытаВ экспериментах как тестовые указаны дрожжевые грибы Saccharomices cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe. По усмотрению преподавателя они могут быть заменены на любые другие дрожжевые грибы, не являющиеся патогенными для человека, и способными расти на контрольной и опытных средах.Приготовление средыдля приготовления 100 мл среды взвесьте 0,3 г дрожжевого экстракта, 1 г пептона и 1 г глюкозы;растворите всё в 80 мл теплой воды;доведите объем смеси до 100 мл водой в мерном цилиндре;перенесите смесь в колбу, закройте её плотно ватно-марлевой пробкой;передайте колбу лаборанту для стерилизации в автоклаве.Заливка автоклавированной среды в пробиркистерилизованную среду охладить до температуры примерно 30°С и добавить в неё по 1 мл стерильных растворов хлортетрациклина или тетрациклина (4 мг/мл) и хлорамфеникола (левомицетина) (2,5 мг/мл);разлить в большие культуральные пробирке по 15-20 мл (в зависимости от размера пробирки) в стерильных условиях (например, в ламинарном шкафу);пробирки можно сразу использовать для инокуляции микроорганизмами.Нанесение образцов на чашки для культивированияв одну пробирку внесите 1 мл суспензии клеток Saccharomices cerevisiae, предоставленную преподавателем;в другую пробирку внесите 1 мл суспензии клеток Schizosaccharomyces pombe, предоставленную преподавателем;поставьте необходимые пометки на пробирках и закройте их;передайте пробирки лаборанту для инкубации до занятия 5.

Протокол выполнения опытаВ экспериментах как тестовые указаны дрожжевые грибы Saccharomices cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe. По усмотрению преподавателя они могут быть заменены на любые другие дрожжевые грибы, не являющиеся патогенными для человека, и способными расти на контрольной и опытных средах.Приготовление средыдля приготовления 100 мл среды нарежьте 20 г неочищенного картофеля тонкими ломтиками;прокипятите 30 мин в 100 мл воды;профильтруйте отвар (ломтики картофеля отбросьте);отвар охладите, добавьте 2 г глюкозы;доведите объем смеси до 100 мл водой в мерном цилиндре;перенесите смесь в колбу, закройте её плотно ватно-марлевой пробкой;передайте колбу лаборанту для стерилизации в автоклаве.Заливка автоклавированной среды в пробиркистерилизованную среду охладить до температуры примерно 30°С и добавить в неё по 1 мл стерильных растворов хлортетрациклина или тетрациклина (4 мг/мл) и хлорамфеникола (левомицетина) (2,5 мг/мл);разлить в большие культуральные пробирке по 15-20 мл (в зависимости от размера пробирки) в стерильных условиях (например, в ламинарном шкафу);пробирки можно сразу использовать для инокуляции микроорганизмами.Нанесение образцов на чашки для культивированияв одну пробирку внесите 1 мл суспензии клеток Saccharomices cerevisiae, предоставленную преподавателем;в другую пробирку внесите 1 мл суспензии клеток Schizosaccharomyces pombe, предоставленную преподавателем;поставьте необходимые пометки на пробирках и закройте их;передайте пробирки лаборанту для инкубации до занятия 5.

Протокол выполнения опытаВ экспериментах как тестовые указаны грибы Penicillium roqueforti и Botrytis cinerea. По усмотрению преподавателя они могут быть заменены на любые другие грибы, не являющиеся патогенными для человека, и способными расти на контрольной и опытных средах.Приготовление средыдля приготовления 100 мл среды взвесьте 3 г сахарозы, 0,2 г натрия нитрата, 0,1 г калия гидрофосфата, 0,05 г магния сульфата, 0,05 г калия хлорида и 10 мг железа(II) сульфата;растворите все в 80 мл теплой воды;добавьте 1,5 г агара, суспендируйте и доведите объем смеси до 100 мл водой в мерном цилиндре;перенесите смесь в колбу и перемешивайте при нагревании на водяной бане до полного растворения агара;закройте колбу плотно ватно-марлевой пробкой;передайте колбу лаборанту для стерилизации в автоклаве.Заливка чашек Петри автоклавированной средойстерилизованную среду немного охладить (не ниже 75°С) и разлить в чашки Петри (или заменяющую их посуду) в стерильных условиях (например, в ламинарном шкафу);после остывания до комнатной температуры чашки со средой можно использовать для инокуляции микроорганизмами.Нанесение образцов на чашки для культивированияпо поверхности одной чашки Петри распределите 0,1 мл суспензии клеток Penicillium roqueforti, предоставленную преподавателем;по поверхности другой чашки Петри распределите 0,1 мл суспензии клеток Botrytis cinerea, предоставленную преподавателем;поставьте необходимые пометки на крышках чашек Петри и закройте их;передайте чашки Петри, лаборанту для инкубации до занятия 5.

Протокол выполнения опытаВ экспериментах как тестовые указаны грибы Penicillium roqueforti и Botrytis cinerea. По усмотрению преподавателя они могут быть заменены на любые другие грибы, не являющиеся патогенными для человека, и способными расти на контрольной и опытных средах.Приготовление средыдля приготовления 100 мл среды возьмите половину чайной ложки сахара и растворите его в 80 мл теплой воды;отмерьте 1 чайную ложку жидкого комплексного удобрения «Калийная селитра» с микро- и макроэлементами с содержанием азота 6-8% и добавьте к смеси, хорошо перемешайте;добавьте 1,2 г агар-агара, суспендируйте и доведите объем смеси до 100 мл водой в мерном цилиндре;перенесите смесь в колбу и перемешивайте при нагревании на водяной бане до полного растворения агар-агара;закройте колбу плотно ватно-марлевой пробкой;передайте колбу лаборанту для стерилизации в автоклаве.Заливка чашек Петри автоклавированной средойстерилизованную среду немного охладить (не ниже 75°С) и разлить в чашки Петри (или заменяющую их посуду) в стерильных условиях (например, в ламинарном шкафу);после остывания до комнатной температуры чашки со средой можно использовать для инокуляции микроорганизмами.Нанесение образцов на чашки для культивированияпо поверхности одной чашки Петри распределите 0,1 мл суспензии клеток Penicillium roqueforti, предоставленную преподавателем;по поверхности другой чашки Петри распределите 0,1 мл суспензии клеток Botrytis cinerea, предоставленную преподавателем;поставьте необходимые пометки на крышках чашек Петри и закройте их;передайте чашки Петри, лаборанту для инкубации до занятия 5.

Выполняется внеаудиторно. Загружается дистанционно для оценки преподавателем с использованием выбранного формата интерактивного общения (LMS, облачное файлохранилище, социальные сети, онлайн-сервисы организации совместной работы и т.д.).

В свободной форме, содержащей:рабочие протоколы выполнения работы,фотографии поэтапного выполнения протоколов.

Дополнительный отчет по всей работе целиком готовится после занятия 5, на котором студенты учитывают результаты роста микроорганизмов. В рамках работы 5/1 подсчитывается количество колоний на чашках Петри (для работы 4/1 учитываются только результаты визуального подсчета). Необходимо сравнить количество колоний, выросших на контрольных и опытных средах.Учет роста в жидких средах проводится количественно турбидиметрическим методом по оптической плотности суспензий клеток при длине волны 595-610 нм (на кюветном или планшетном фотометре) или полуколичественно путем сравнения мутности суспензий со стандартами мутности МакФарланда

Arulanantham R., Pathmanathan S., Ravimannan N., Niranjan K. Alternative culture media for bacterial growth using different formulation of protein sources. J. Nat. Prod. Plant Resour. 2012; 2(6): 697-700.

Basu S, Bose C, Ojha N, Das N, Das J, Pal M, Khurana S. Evolution of bacterial and fungal growth media. Bioinformation. 2015; 11(4): 182-184. doi: 10.6026/97320630011182

Mosher R., Crawford K., Lukowiak A. A Soy-Based Alternative to Traditional Bacterial Nutrient Media. American Biol. Teacher. 2009; 71(1): 49-51. doi:10.1662/005.071.0111

их долгое время называли «сине-зелеными водорослями»