Mini préparation d'ADN plasmidique
Isolation de l'ADN plasmidique
Centrifugation des bactéries
Culot de bactéries
Digestion des bactéries / Solution S1
RNase I
Clive l'ARN
EDTA
Chélateur d'ions divalents (Ca, Mg)
Permet d'inactiver les DNases qui dépendent de ces ions
Dénaturation controlée de l'ADN plasmidique / Solution S2
NaOH
pH basique
Dénaturation des protéines
SDS
Détergent
Déstructuration des membranes
Précipitation différentielle de l'ADN plasmidique / Solution S3
pH = 4 (acide)
Stoppe la dénaturation controlée
Acétate de potassium
Précipite d'ADN plasmidique lié au SDS
Lavage de l'ADN
Ethanol
Laisser évaporer
Clonage
Préparation des bactéries
Digestion par enzymes de restriction
Ligation de l'ADN d'intérêt
Enzyme de ligation : Ligase
Electroporation des bactéries
Choc électrique
Choc thermique
Sélection des bactéries
Culture sur antibiotique de sélection
Ampicilline
Repiquage des colonies positives
Culture des colonies en milieu liquide
Digestion / Cartographie de l'ADN plasmidique
Digestion par enzymes de restriction
BamHI
Eco RI
Hind III
Cartographie du plasmide
Comparaison avec les résultats attendues
Détermination du sens d'insertion du plasmide