La PCR digital ha demostrado ser una nueva tecnología valiosa y, con perspectivas de mejoras adicionales, es probable que madure hasta convertirse en una herramienta indispensable en futuras investigaciones sobre el VIH.
Calculan un umbral para cada nube de gotitas y excluyen las gotitas fluorescentes intermedias de análisis posteriores.
Método no revelado para la asignación automática de umbrales.
configuración manual de umbrales por parte del usuario final.
PCR Digital Como Herramienta para Medir la
Persistencia del VIH
Rutsaert, S. at al. (2018) Digital PCR as a tool to measure HIV
persistence. Retrovirology.
Aplicabilidad y perspectivas de futuro.
La ddPCR multiplexada puede mejorar nuestra comprensión de la brecha entre el crecimiento viral y los ensayos basados en PCR.
La ddPCR multiplexada podría ayudar a determinar el número de veces que se reproduce una secuencia del VIH.
El sistema Naica de Stilla permite actualmente la inspección visual del tamaño y la geometría de una gota de un solo cristal y la exclusión de aquellas que son aberrantes.
Aunque la PCR digital permite la cuantificación precisa del ADN y ARN del VIH en pacientes, no permite a los investigadores obtener información sobre la competencia de replicación del reservorio.
Medición del reservorio del VIH mediante PCR digital.
Agentes reversores de latencia (LRA).
Inmunización mediante anticuerpos ampliamente neutralizantes.
Interrupciones estructuradas del tratamiento.
Trasplante alogénico de células madre.
Vacunación terapéutica.
Utilizado para medir los efectos del inicio temprano del tratamiento.
Desafíos y beneficios de la PCR digital en gotas.
QX200 es la plataforma de PCR digital más utilizada.
Plataformas PCR digitales.
CONSTELLATION® DPCR
5 longitudes de onda de sonda por muestra.
Software: CONSTELLATION®.
Cámaras de microfluidos.
Compañía: Formulatrix
QX200™ Droplet Digital™ PCR
Software: QuantaSoft™.
Gotitas de tamaño nanométrico.
Compañía: Bio-Rad
RainDrop plus™
Software: RainDrop Analyst II™.
Gotitas de tamaño picoso.
Compañía: RainDance™ Technologies
Naica
Detección de 3 colores (FAM/VIC/Cy5).
Software: Crystal Miner.
Gotas de cristal en una matriz.
Compañía: Stilla Technologies
QuantStudio™ 3D
2 canales de detección (FAM/VIC).
Software: QuantStudio™ 3D Analy- sisSuite™.
Detección punto final.
Chip.
Compañía: Applied Biosystems/Life technologies™
Biomarca
Detección de hasta 3 colorantes fluorescentes por ensayo.
Software: Análisis de PCR digital.
Detección tiempo real y punto final.
Circuitos fluídicos integrados
(IFCS) matrices.
Compañía: Fluidigm™
Diana Marcela Parra Contreras
Universidad Manuela Beltrán
Neurobiología
Corte V12
Profesor Juan Bravo
Determinación del umbral.
Enfoques
Lievens et al.
Determinan el umbral en función de la forma de los picos de densidad de fluorescencia, pero para tener en cuenta la posibilidad de que las nubes no estén distribuidas normalmente, establezca el umbral por encima del límite superior de la nube negativa.
Método de umbral
Trypsteen et al.
Alimenta datos de controles negativos a un modelo de valor extremo generalizado y aplica este umbral a las muestras.
Asigna un umbral independientemente de los muchos factores que pueden afectar la intensidad y distribución de la fluorescencia de las gotas.
Método de determinación de umbral único
Dreo et al.
Se define como la señal de fluorescencia media en los NTC (sin controles de plantilla) más un número de desviaciones estándar hasta que quede una gota positiva en los NTC.
Las gotas con intensidad de fluorescencia intermedia pueden contener gotas positivas verdaderas.
Métodos de agrupamiento
Jones et al.
Desarrolló "definetherain" que utiliza muestras decontrol positivas y negativas para identificar las dos nubes.
Strain et al.
Mediana y la varianza de las nubes negativas y positivas para evaluar la probabilidad estadística de que se incluyan valores atípicos en cualquiera de las nubes.
Separación entre gotas positivas y negativas
Puede depender de
Lluvia
Definir un umbral se complica por las gotas con una fluorescencia intermedia.
Su población positiva o negativa es complicada.
En ddPCR, las gotitas generadas se identifican como positivas o negativas según un umbral en un determinado nivel de fluorescencia.
Software QuantaSoft
Ofrece
Se utiliza para calcular la abundancia objetivo mediante estadísticas de Poisson.
Determinar un umbral correcto es crucial para una cuantificación confiable.
Falsos positivos.
Pueden suponer una amenaza para la cuantificación fiable del ADN del VIH en entornos con bajas concentraciones de ADN del VIH.
Transmisión de madre a hijo.
Después de un trasplante exitoso de células madre, los pacientes siguen recibiendo tratamiento antirretroviral y se les monitorean los niveles de ADN del VIH.
Transmisión temprana al inicio del tratamiento.
Alotrasplante de células madre (aloSCT).
Uno de cada tres pocillos de controles negativos sin plantilla tenía 2 o 3 gotitas positivas (0,16–0,22 copias/reacción) para el ensayo de ARN del VIH-1 descrito por Kiselinova et al.
Estas gotitas tenían un nivel de fluorescencia similar al de las gotitas positivas en las muestras de pacientes.
AlloSCT es actualmente el único método conocido mediante el cual se puede reducir drásticamente el reservorio del VIH.
Pueden surgir de:
Contaminaciones.
Gotitas alteradas que se fusionan.
Su fluorescencia conjunta da lugar a una gotita con una fluorescencia inicial más alta que se denomina erróneamente positiva.
Independientemente del método que se utilice para asignar un umbral, las plataformas de PCR digitales disponibles actualmente sufren la observación de particiones falsas
positivas y, por lo tanto, resultados falsos positivos.
Ventajas.
En caso de una verdadera falla en la amplificación, actualmente no está claro si este modo potencial de subestimación del objetivo se refiere únicamente a la PCR digital o si existen mecanismos similares en juego en el caso de (q) PCR.
En experimentos de PCR digital dúplex en objetivos vinculados, se observó una minoría de particiones en las que solo uno de dos ensayos demostró amplificación.
La cuantificación precisa mediante qPCR se basa en la calidad de la curva estándar.
La inestabilidad de la curva estándar puede provocar una cuantificación inexacta del ADN del VIH.
La PCR digital produce una
cuantificación absoluta directa.
Los resultados absolutos de la cuantificación producidos por la PCR digital eliminan la necesidad de una curva estándar en el caso de cuantificaciones de ADN y comparaciones de cuantificaciones de ARN.
