1/2. Как изучить пищевое поведение инфузорий?

Ver más

Моллюски

por Мария Кузнецова

Царства природы

por Земзерова Любовь

Живые организмы

por VuvuzelaMs VuvuzelaMs

культуры клеток и культивирование бактерий

por Лазарева Людмила

что инфузория может поглощать в качестве (или вместо) пищи?

любые другие частицы подходящего размера

сажа, китайская тушь и т.д.

суспензии окрашенных слабо растворимых солей

латексные частицы

дрожжи

окрашенные дрожжи

Поскольку дрожжи сами имеют слабую окраску (или не имеют ее вообще), их не всегда легко разглядеть при низком увеличении. Для улучшения идентификации дрожжи дополнительно прокрашивают различными красителями, например, сафранином, метиленовым голубыми, конго красным или бриллиантовым зеленым

бактерии

количество и размер пищеварительных вакуолей, частота сокращений сократительной вакуоли

Статьи для чтения

Fels, 2017

Fels D. Endogenous physical regulation of population density in the freshwater protozoan Paramecium caudatum. Sci. Rep. 2017; 7: 13800. doi: 10.1038/s41598-017-14231-0

Лабораторная работа 1/2

оформление результатов

Выполняется внеаудиторно. Загружается дистанционно для оценки преподавателем с использованием выбранного формата интерактивного общения (LMS, облачное файлохранилище, социальные сети, онлайн-сервисы организации совместной работы и т.д.).

1/1 в. описательное

В свободной форме, обязательно отражающей:

1. цель эксперимента,
2. проверяемую научную гипотезу (формулируется самим студентом),
3. протокол эксперимента,
4. результаты эксперимента с китайской тушью,
5. сравнительный анализ результатов оценки пищевого поведения инфузорий с разным периодом голодания,
6. общий вывод из экспериментов 1/2 б и 1/2 в.

Эссе рекомендуется сопровождать изображениями и / или видеофайлами, полученными в ходе экспериментов.

1/1 б - описательное

В свободной форме, обязательно отражающей:

1. цель эксперимента,
2. проверяемую научную гипотезу (формулируется самим студентом),
3. протокол эксперимента,
4. результаты эксперимента с окрашенными дрожжами,
5. сравнительный анализ результатов оценки пищевого поведения инфузорий с разным периодом голодания,
6. сравнительный анализ экспериментов с дрожжами, окрашенными различными красителями (в качестве эталонного красителя использовать конго красный),
7. общий вывод с указанием, была ли подтверждена научная гипотеза.

Эссе рекомендуется сопровождать изображениями и / или видеофайлами, полученными в ходе экспериментов.

1/1 а - описательное

В свободной форме, отражающей:

1. цель эксперимента,
2. протокол выполнения работы,
3. пошаговые иллюстрации выполнения протокола в виде фото- или видеофайлов:
4. общий вывод с указанием, удалось ли получить препарат окрашенных дрожжей для последующих экспериментов.

лабораторные протоколы

1/1 в. Исследование пищевого поведения инфузорий с китайской тушью

Протокол выполнения единичного опыта

Исследуемые клетки: «сытые» и «голодные» инфузории.

Важно! не допускайте пересыхания капли с инфузориями в ходе работы; при необходимости добавляйте к капле на предметном стекле небольшие количества среды Лозино-Лозинского

Ход выполнения

1. возьмите каплю китайской (или аналогичной) туши, приготовленной из сажи или иных видов коллоидного углерода, и разведите её 5-15-кратным объемом воды;
2. подготовьте предметное стекло для работы, обезжирив его изопропанолом;
3. отберите из сосуда с культурой инфузорий небольшую аликвоту, используя пастеровскую или глазную пипетку, стараясь, чтобы в отобранный объем жидкости попало по крайней мере несколько инфузорий, желательный объем капли не более 50 мкл;
4. нанесите каплю культуры на предметное стекло таким образом, чтобы в капле были видны хотя бы несколько инфузорий;
5. изучите поведение инфузорий невооруженным взглядом, с помощью лупы (увеличение от 2 до 10^х), под бинокулярными микроскопом (увеличение 4-20^х) и с помощью увеличительной линзы (4-20^х) для смартфона;
6. нанесите на предметное стекло рядом с культурой инфузорий каплю разведенной суспензии китайской туши;
7. соедините капли между собой, наблюдайте изменения в поведении инфузорий;
8. оцените, существуют ли отличия в поведении «сытых» и «голодных» инфузорий.

1/1 б. Исследование пищевого поведения инфузорий с окрашенными дрожжами

Протокол выполнения единичного опыта

Исследуемые клетки: «сытые» и «голодные» инфузории.

Важно! не допускайте пересыхания капли с инфузориями в ходе работы; при необходимости добавляйте к капле на предметном стекле небольшие количества среды Лозино-Лозинского

Ход выполнения

1. подготовьте предметное стекло для работы, обезжирив его изопропанолом;
2. отберите из сосуда с культурой инфузорий небольшую аликвоту, используя пастеровскую или глазную пипетку, стараясь, чтобы в отобранный объем жидкости попало по крайней мере несколько инфузорий, желательный объем капли не более 50 мкл;
3. нанесите каплю культуры на предметное стекло таким образом, чтобы в капле были видны хотя бы несколько инфузорий;
4. изучите поведение инфузорий невооруженным взглядм, с помощью лупы (увеличение от 2 до 10^х), под бинокулярными микроскопом (увеличение 4-20^х) и с помощью увеличительной линзы (4-20^х) для смартфона;
5. нанесите на предметное стекло рядом с культурой инфузорий каплю суспензии окрашенных дрожжей;
6. соедините капли между собой, наблюдайте изменения в поведении инфузорий;
7. оцените, существуют ли отличия в поведении «сытых» и «голодных» инфузорий.

1/2 а. Окрашивание дрожжевых клеток

Протокол выполнения опыта

Красители: предлагаются преподавателем в виде сухих реагентов. Примеры красителей, которые могут быть использованы в работе: нейтральный красный, конго красный, метиловый зеленый, кристаллический фиолетовый, метиленовый голубой, тартразин, бриллиантовый синий FCF, сансет желтый FCF, ализариновый красный С, родамин Ж, родамин С, понсо 4R (Е124), метиловый красный, бриллиантовый зеленый.

Ход выполнения

1. рассчитайте массу навески красителя для приготовления 10 мл 0,25% раствора красителя, взвесьте выбранный краситель и приготовьте 10 мл необходимого раствора;
2. взвесьте 0,02 г сухих быстродействующих дрожжей;
3. суспендируйте их в 1 мл воды;
4. поместите суспензию дрожжей в термостат при температуре 70˚C на 30 минут;
5. суспензию мертвых дрожжевых клеток охладите и центрифугируйте 5 мин при ускорении 1000 g;
6. надосадочную жидкость аккуратно отберите и отбросьте;
7. добавьте к клеточному осадку 1 мл 0,85% NaCl (можно использовать аптечный физиологический раствор), суспендируйте полностью и вновь центрифугируйте, как указано выше (п.5);
8. отмывку дрожжей (пп.6-7) повторите еще дважды; надосадочная жидкость после последней отмывки должна быть прозрачной;
9. суспендируйте дрожжи в 1 мл воды;
10. добавьте к суспензии мертвых дрожжевых клеток 200 мкл приготовленного вами раствора красителя;
11. оставшийся раствор красителя сохраните для использования в дальнейших экспериментах на данном и последующих занятиях;
12. инкубируйте 10 минут при комнатной температуре;
13. суспензию центрифугируйте 5 мин при ускорении 1000 g;
14. отберите и отбросьте надосадочную жидкость;
15. суспендируйте осадок в 1 мл воды и вновь центрифугируйте, как указано выше
16. суспендируйте осадок в 250-500 мкл воды.

организация работы

Подготовительная часть (преподаватель + лаборант): подготовка необходимых материалов и оборудования, двух культур инфузорий (покормленные в день проведения занятия - «сытые» и покормленные не позже, чем за 4 дня до занятия, - «голодные»).

Подготовительная часть (лаборант): поддержание культуры инфузорий Paramecium caudatum в среде Лозино-Лозинского при температуре 25°С.

Основная часть (студенты на занятии): приготовление окрашенных дрожжей - в парах (один краситель); затем каждая пара проверяет пищевое поведение в отношении полученного препарата «голодной» культуры инфузорий (один из студентов в паре) и «сытой» культуры (другой студент); аналогично в парах выполняется работа с китайской тушью.

Важно! Поскольку студенты работают с разными условиями экспериментов преподавателю следует обеспечить студентам возможность ознакомиться с результатами друг друга. Делать это в ходе выполнения эксперимента или во время заключительного мини-коллоквиума занятия - выбор преподавателя.

результаты обучения

вопросы для обсуждения

1. Почему инфузории могут поглощать практически любые частицы определенного размера, даже если они не смогут их переварить?
2. Какого размера частицы поглощаются инфузориями путем пиноцитоза?
3. Будет ли отличаться поглощение живых и мертвых дрожжей инфузориями?
4. Есть ли разница, каким красителем покрасить дрожжи для дальнейшего использования в экспериментах по пищевому поведению инфузорий?
5. Можно ли окрасить дрожжи какими-либо пищевыми или текстильными красителями для дальнейшего использования в экспериментах с инфузориями?

развиваемые навыки

• формулировать научную гипотезу для последующей экспериментальной проверки
• делать выводы из сравнительного анализа результатов экспериментов с различными воздействиями на объект изучения

Инфузории

Одна из наиболее широко применяемых в отечественных исследованиях сред для выращивания инфузорий рода Paramecium - среда Лозино-Лозинского.

Обычно она готовится в виде концентрата 10-кратной концентрации (10x). Концентрат среды Лозина-Лозинского готовится следующим образом: в 1 литре дистиллированной воды растворяют 0,1 г NaCl, 0,01 г KCl, 0,2 г NaHCO₃, 0,01 г MgSO₄ х 7 H₂O, 0,01 г CaCl₂. Для приготовления рабочего раствора (инкубационной смеси) смешивают 1 объем концентрата с 9 объемами воды (например, 100 мл концентрата + 900 мл воды).

Культура парамеций лучше всего выращивать при температуре 20-25˚C с естественной рассеянной освещенностью в течении дня или с искусственным чередованием света и темноты («день-ночь») 12 + 12 часов в течение суток.

В качестве корма можно использовать множество веществ и продуктов, но одним из самых простых, доступных и легко стандартизируемых вариантов являются обычные сухие пекарские дрожжи. Активные (быстрорастворимые) дрожжи лучше, чем те, которые требуют предварительной инкубации в жидкости. Рекомендуемый режим кормления 0,07 г сухих дрожжей на культуру объемом 400-600 мл 2 раза в неделю. Перед добавлением в культуру дрожжи суспендируются в 10 мл воды для более равномерного распределения в культуре.

Через каждые 1-2 недели культуру инфузорий требуется отмывать от остатков корма и продуктов метаболизма. Для этого культуру инфузорий переливают в узкогорлую колбу, которую накрывают темной тканью, оставляя открытым горлышко. Средой Лозино-Лозинского доводят до верха. Через некоторое время инфузории выплывают в верхнюю часть колбы, после чего их отбирают дозатором на 10 мл и переносят в чистый стакан, а затем снова доливают средой Лозино-Лозинского. Процедура повторяется до тех пор, пока культура не станет прозрачной. После отмывки инфузории необходимо покормить, а на сосуд с ними поставить дату последней отмывки.

можно изучать поведение, а не только количество или внутреннее строение

изменения в поведении могут оказаться последствиями более слабых воздействий внешних факторов (химических, физических, биологических), чем детектируемые изменения клеточной и внутриклеточной морфологии - а гибель клетки будет наступать точно после изменений и поведения, и морфологии

таксис

пищевое поведение

направление перемещания

скорость движения

2019, Валерий Зайцев. Это произведение доступно по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial («Атрибуция — Некоммерческое использование») 4.0 Всемирная

1/2. Как изучить пищевое поведение инфузорий?