4/2. Можно ли быстро стерилизовать микробиологические среды в микроволновке?

Ver más

Cенсорные системы

por Nik Kasyanov

Уравнение состояния идеального газа. Газовые законы.

por Егор Казанский

Зелёные нитчатые водоросли

por Viktoria Ryhlinskaja

Температура. Види термометрів.

por Аліна Сорочинська

микроволновая обработка

споровые микроорганизмы могут выжить

нет расходных материалов

в обычной микроволновке

быстро

Использованные публикации

Wynn, Dixon, 1988

Wynn B., Dixon A. Microwave sterilization in school microbiology. J. Biol. Educ. 1988; 22(4) 289-294. doi: 10.1080/00219266.1988.9655002

Shareef e.a., 2019

Shareef S.A., Hamasaeed P.A., Ismaeil A.S. Sterilization of Culture Media for Microorganisms Using a Microwave Oven Instead of Autoclave. Rafidain J. Sci. 2019; 28(2): 1-6. doi: 10.33899/rjs.2019.159390

Sanborn e.a., 1982

Sanborn M.R., Wan S.K., Bulard R. Microwave sterilization of plastic tissue culture vessels for reuse. Appl. Environ. Microbiol. 1982; 44(4): 960-964.

Prijana e.a., 2016

Prijana C., Mulyana Y., Hidayat B. Roles of Microwave Oven in Preparing Microbiological Growth Media. Althea Med. J. 2016; 3(1): 1-5. DOI: 10.15850/amj.v3n1.469

Kothari e.a., 2011

Kothari V., Patadia M., Trivedi N. Microwave sterilized media supports better microbial growth than autoclaved media. Res. Biotechnol. 2011; 2(5): 63-72.

Bhattacharjee, Delsol, 2014

Bhattacharjee M.K., Delsol J.K. Does microwave sterilization of growth media involve any non-thermal effect? J. Microbiol. Methods. 2014; 96: 70-72. doi: 10.1016/j.mimet.2013.11.002

Baqai, Hafiz, 1992

Baqai R., Hafiz S. Microwave oven in microbiology laboratory. J. Pak. Med. Assoc. 1992; 42(1): 2-3.

Лабораторная работа 4/2

оформление результатов

Выполняется внеаудиторно. Загружается дистанционно для оценки преподавателем с использованием выбранного формата интерактивного общения (LMS, облачное файлохранилище, социальные сети, онлайн-сервисы организации совместной работы и т.д.).

все протоколы - описательное

В свободной форме, содержащей:

1. рабочие протоколы выполнения работы,
2. фотографии поэтапного выполнения протоколов.

лабораторные протоколы

Протоколы

Важно! В лабораторной работе 4/2 НЕ производится инокуляции питательных сред микроорганизмами.

4/2 е. Приготовление агара на основе селитряного удобрения

Протокол выполнения опыта

Приготовление среды

1. для приготовления 100 мл среды возьмите половину чайной ложки сахара и растворите его в 80 мл теплой воды;
2. отмерьте 1 чайную ложку жидкого комплексного удобрения «Калийная селитра» с микро- и макрооэлементами с содержанием азота 6-8% и добавьте к смеси, хорошо перемешайте;
3. добавьте 1,2 г агар-агара, суспендируйте и доведите объем смеси до 100 мл водой в мерном цилиндре;
4. перенесите смесь в колбу и перемешивайте при нагревании на водяной бане до полного растворения агар-агара;
5. закройте колбу плотно ватно-марлевой пробкой.

Стерилизация среды

1. полученную среду без комочков перелить в стеклянную бутыль со слегка недокрученной автоклавируемой резьбовой крышкой типа GL45 и стерилизовать в микроволновой печи в течение 10 мин на мощности 700 Вт.

Заливка чашек Петри автоклавированной средой

1. стерилизованную среду немного охладить (не ниже 75°С) и разлить в чашки Петри (или заменяющую их посуду) в стерильных условиях (например, в ламинарном шкафу);
2. после остывания до комнатной температуры чашки со средой можно использовать для инокуляции микроорганизмами.
3. поставьте необходимые пометки на крышках чашек Петри и закройте их;
4. передайте чашки Петри, лаборанту для инкубации до занятия 5.

4/2 д. Приготовление агара Чапека

Протокол выполнения опыта

Приготовление среды

1. для приготовления 100 мл среды взвесьте 3 г сахарозы, 0,2 г натрия нитрата, 0,1 г калия гидрофосфата, 0,05 г магния сульфата, 0,05 г калия хлорида и 10 мг железа(II) сульфата;
2. растворите все в 80 мл теплой воды;
3. добавьте 1,5 г агара, суспендируйте и доведите объем смеси до 100 мл водой в мерном цилиндре;
4. перенесите смесь в колбу и перемешивайте при нагревании на водяной бане до полного растворения агара;
5. закройте колбу плотно ватно-марлевой пробкой.

Стерилизация среды

1. полученную среду без комочков перелить в стеклянную бутыль со слегка недокрученной автоклавируемой резьбовой крышкой типа GL45 и стерилизовать в микроволновой печи в течение 10 мин на мощности 700 Вт.

Заливка чашек Петри стерилизованной средой

1. стерилизованную среду немного охладить (не ниже 75°С) и разлить в чашки Петри (или заменяющую их посуду) в стерильных условиях (например, в ламинарном шкафу);
2. после остывания до комнатной температуры чашки со средой можно использовать для инокуляции микроорганизмами.
3. поставьте необходимые пометки на крышках чашек Петри и закройте их;
4. передайте чашки Петри, лаборанту для инкубации до занятия 5.

4/2 г. Приготовление картофельно-глюкозного бульона

Протокол выполнения опыта

Приготовление среды

1. для приготовления 100 мл среды нарежьте 20 г неочищенного картофеля тонкими ломтиками;
2. прокипятите 30 мин в 100 мл воды;
3. профильтруйте отвар (ломтики картофеля отбросьте);
4. отвар охладите, добавьте 2 г глюкозы;
5. доведите объем смеси до 100 мл водой в мерном цилиндре;
6. перенесите смесь в колбу, закройте её плотно ватно-марлевой пробкой.

Стерилизация среды

1. полученную среду без комочков перелить в стеклянную бутыль со слегка недокрученной автоклавируемой резьбовой крышкой типа GL45 и стерилизовать в микроволновой печи в течение 10 мин на мощности 700 Вт.

Заливка стерилизованной среды в пробирки

1. стерилизованную среду охладить до температуры примерно 30°С и добавить в неё по 1 мл стерильных растворов хлортетрациклина или тетрациклина (4 мг/мл) и хлорамфеникола (левомицетина) (2,5 мг/мл);
2. разлить в большие культуральные пробирки по 15-20 мл (в зависимости от размера пробирки) в стерильных условиях (например, в ламинарном шкафу);
3. поставьте необходимые пометки на пробирках и закройте их;
4. передайте пробирки лаборанту для инкубации до занятия 5.

4/2 в. Приготовление жидкой среды YPD

Протокол выполнения опыта

Приготовление среды

1. для приготовления 100 мл среды взвесьте 0,3 г дрожжевого экстракта, 1 г пептона и 1 г глюкозы;
2. растворите всё в 80 мл теплой воды;
3. доведите объем смеси до 100 мл водой в мерном цилиндре;
4. перенесите смесь в колбу, закройте её плотно ватно-марлевой пробкой.

Стерилизация среды

1. полученную среду без комочков перелить в стеклянную бутыль со слегка недокрученной автоклавируемой резьбовой крышкой типа GL45 и стерилизовать в микроволновой печи в течение 10 мин на мощности 700 Вт.

Заливка стерилизованной среды в пробирки

1. стерилизованную среду охладить до температуры примерно 30°С и добавить в неё по 1 мл стерильных растворов хлортетрациклина или тетрациклина (4 мг/мл) и хлорамфеникола (левомицетина) (2,5 мг/мл);
2. разлить в большие культуральные пробирке по 15-20 мл (в зависимости от размера пробирки) в стерильных условиях (например, в ламинарном шкафу);
3. поставьте необходимые пометки на пробирках и закройте их;
4. передайте пробирки лаборанту для инкубации до занятия 5.

4/2 б. Приготовление твердой среды из сухого пищевого бульона

Протокол выполнения опыта

Приготовление среды

1. для приготовления 100 мл среды возьмите 2 чайных ложки сахара и 1 чайную ложку куриного или говяжего сухого бульона;
2. хорошо размешайте всё в 80 мл теплой воды;
3. добавьте 1,2 г агар-агара, суспендируйте и доведите объем смеси до 100 мл водой в мерном цилиндре;
4. перенесите смесь в колбу и перемешивайте при нагревании на водяной бане до полного растворения агар-агара;
5. закройте колбу плотно ватно-марлевой пробкой;
6. передайте колбу лаборанту для стерилизации в автоклаве.

Стерилизация среды

1. полученную среду без комочков перелить в стеклянную бутыль со слегка недокрученной автоклавируемой резьбовой крышкой типа GL45 и стерилизовать в микроволновой печи в течение 10 мин на мощности 700 Вт.

Заливка чашек Петри стерилизованной средой

1. стерилизованную среду немного охладить (не ниже 75°С) и разлить в чашки Петри (или заменяющую их посуду) в стерильных условиях (например, в ламинарном шкафу);
2. после остывания до комнатной температуры чашки со средой можно использовать для инокуляции микроорганизмами.
3. поставьте необходимые пометки на крышках чашек Петри и закройте их;
4. передайте чашки Петри, лаборанту для инкубации до занятия 5.

4/2 а. Приготовление LB-агара

Протокол выполнения опыта

Приготовление среды

1. для приготовления 100 мл среды взвесьте 1 г ферментативного гидролизата казеина (или триптона, или пептона), 0,5 г дрожжевого экстракта и 1 г NaCl;
2. растворите NaCl в 80 мл теплой воды;
3. в полученном солевом растворе растворите остальные компоненты среды;
4. добавьте 1,5 г агара, суспендируйте и доведите объем смеси до 100 мл водой в мерном цилиндре;
5. перенесите смесь в колбу и перемешивайте при нагревании на водяной бане до полного растворения агара;
6. закройте колбу плотно ватно-марлевой пробкой.

Стерилизация среды

1. полученную среду без комочков перелить в стеклянную бутыль со слегка недокрученной автоклавируемой резьбовой крышкой типа GL45 и стерилизовать в микроволновой печи в течение 10 мин на мощности 700 Вт.

Заливка чашек Петри стерилизованной средой

1. стерилизованную среду немного охладить (не ниже 75°С) и разлить в чашки Петри (или заменяющую их посуду) в стерильных условиях (например, в ламинарном шкафу);
2. после остывания до комнатной температуры чашки со средой можно использовать для инокуляции микроорганизмами.
3. поставьте необходимые пометки на крышках чашек Петри и закройте их;
4. передайте чашки Петри, лаборанту для инкубации до занятия 5.

организация работы

Данная лабораторная работа использует те же протоколы, что и лабораторная работа 4/1, за исключением способа стерилизации и инокуляцией микроорганизмами. Поэтому - по усмотрению преподавателя - все среды из работы 4/1 могут быть приготовлены сразу в удвоенном объеме, а затем они делятся на две равных порции (для стерилизации автоклавированием и микроволновой обработкой), либо среды готовятся по отдельности в рамках каждой лабораторной работы.

В работе используются три контрольных среды (обычно используемые в лабораториях) и три опытных среды (из легко доступных компонентов).

Подготовительная часть (преподаватель + лаборант): подготовка необходимых материалов и оборудования.

Основная часть 1 (студенты в начале занятия): студенты делятся на подгруппы по числу приготавливаемых питательных сред (контрольных и опытных). Студенты стерилизуют свои среды сами в микроволновой печи, а затем разливают свои твердые среды после стерилизации по стерильным чашкам Петри (2 чашки с каждой средой), а жидкие - по стерильным пробиркам (2 с каждой средой); после остывания сред - засевают чашки и пробирки микроорганизмами.

Последующая часть (лаборант): инкубация чашек Петри и пробирок с питательными средами, инокулированных образцами, в термостате (25°С для грибов и 37°С для дрожжей и бактерий) в течение недели до дня занятия 5.

результаты обучения

вопросы для обсуждения

1. В чем принципиальные отличия стерилизации культуральных сред микроволновой обработкой от других способов стерилизации?
2. Как условия обработки в микроволновой печи могут повлиять на эффективность стерилизации питательных микробиологических сред?
3. Могут ли быть ситуации, в которых микроволновая стерилизация в микробиологической лаборатории будет полностью неэффективна или неприменима?

развиваемые навыки

• готовить питательные среды по известным прописям
• стерилизовать питательные среды
• работать в асептических условиях

Стерилизация питательных сред

Одна из наиболее широко применяемых в отечественных исследованиях сред для выращивания инфузорий рода Paramecium - среда Лозино-Лозинского.

Обычно она готовится в виде концентрата 10-кратной концентрации (10x). Концентрат среды Лозина-Лозинского готовится следующим образом: в 1 литре дистиллированной воды растворяют 0,1 г NaCl, 0,01 г KCl, 0,2 г NaHCO₃, 0,01 г MgSO₄ х 7 H₂O, 0,01 г CaCl₂. Для приготовления рабочего раствора (инкубационной смеси) смешивают 1 объем концентрата с 9 объемами воды (например, 100 мл концентрата + 900 мл воды).

Культура парамеций лучше всего выращивать при температуре 20-25˚C с естественной рассеянной освещенностью в течении дня или с искусственным чередованием света и темноты («день-ночь») 12 + 12 часов в течение суток.

В качестве корма можно использовать множество веществ и продуктов, но одним из самых простых, доступных и легко стандартизируемых вариантов являются обычные сухие пекарские дрожжи. Активные (быстрорастворимые) дрожжи лучше, чем те, которые требуют предварительной инкубации в жидкости. Рекомендуемый режим кормления 0,07 г сухих дрожжей на культуру объемом 400-600 мл 2 раза в неделю. Перед добавлением в культуру дрожжи суспендируются в 10 мл воды для более равномерного распределения в культуре.

Через каждые 1-2 недели культуру инфузорий требуется отмывать от остатков корма и продуктов метаболизма. Для этого культуру инфузорий переливают в узкогорлую колбу, которую накрывают темной тканью, оставляя открытым горлышко. Средой Лозино-Лозинского доводят до верха. Через некоторое время инфузории выплывают в верхнюю часть колбы, после чего их отбирают дозатором на 10 мл и переносят в чистый стакан, а затем снова доливают средой Лозино-Лозинского. Процедура повторяется до тех пор, пока культура не станет прозрачной. После отмывки инфузории необходимо покормить, а на сосуд с ними поставить дату последней отмывки.

как можно делать?

мембранная фильтрация

дорогие расходные материалы

хорошая стерильность

в автоклаве

Основной лабораторный метод стерилизации

достаточно долго

сложное и дорогое оборудование

максимальная стерильность

кипячением

достаточно колбы и нагрева

легко и просто

не все микробы погибнут

зачем?

чтобы в среду не попали микроорганизмы из окружающей среды и не исказили результаты опыта

2019, Валерий Зайцев. Это произведение доступно по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial («Атрибуция — Некоммерческое использование») 4.0 Всемирная

4/2. Можно ли быстро стерилизовать микробиологические среды в микроволновке?