Inmuno-Analisis

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1.6.1 EIA Heterogeneo

La reacción antígeno-anticuerpo no modifica la actividad del marcador enzimático

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

- Peroxidasa de rábano - Fosfatasa alcalina - β-D-Galactosidasa - Glucosa oxidasa - Glucoamilasa - Anhidrasa carbónica - Acetilcolinesterasa - Catalasa

Indirecto

- Uso de antígenos inmovilizados - Reacción con muestra de anticuerpos - Lavado y reacción con anticuerpo marcado enzimáticamente - Medición de anticuerpos específicos contra virus, IgM e IgG

Tipo “Sándwich

- Anticuerpo inmovilizado en fase sólida - Incubación con antígeno estándar o de prueba - Lavado y adición de anticuerpo marcado enzimáticamente - Incubación con solución de sustrato enzimático - Medición del producto enzimático

- Antígeno marcado por una enzima - Conjugados de enzima-anticuerpo

Pasos

1. Anticuerpo específico se une a una matriz de fase sólida 2. Lavado para eliminar anticuerpos no unidos 3. Incubación con antígeno marcado enzimáticamente y antígeno estándar/prueba 4. Lavado con tampón 5. Incubación de la fase sólida con solución de sustrato enzimático 6. Medición espectrofotométrica del producto de reacción

1.2 Cinetica de reacciones

-Estudio de la velocidad de las reacciones inmunológicas -Análisis de factores que afectan la tasa de estas reacciones

Factores que Afectan la Cinética

Presencia de Catalizadores: -Enzimas que pueden acelerar la reacción

pH del Medio: -Influencia en la actividad y estabilidad de antígenos y anticuerpos

Temperatura: Afecta la velocidad de las reacciones enzimáticas

Concentración de Reactantes: -Antígeno -Anticuerpo

1.1Anticuerpo

- Molécula bi-funcional - Se une a Antígenos mediante la Región Hiper-variable - Se une a células por la región Fc

- Origen - Especificidad frente al huésped - Reacciones inmunológicas

Inmuno-Analisis

1.6 Enzimoinmunoanalisis

1.7.0 Inmunoanálisis por fluorescencia (FIA)

1.8 Radioinmunoanálisis (RIA)

1.9 Inmunoanálisis de precipitación

1.10. Western Blot (WB)

1.11 Citometría de flujo

Determinación de estirpe celular, etapa de maduración, estado de activación - Uso de sondas fluorescentes y fluorímetro con láser

Tipos de WB

Double blotting

Far-Western blotting

- Técnica para detectar proteínas

Etapas

extracción, electroforesis, transferencia, bloqueo, detección

Metodos

Inmuno-precipitación en geles - Inmunodifusión radial (IDR) - Técnica de electroinmunodifusión de dimensión simple

Otros métodos inmunoelectroforéticos - Inmunoelectroforesis

Otros métodos de Inmuno precipitación - Inmunoanálisis nefelométricos - Turbidimetría - Nefelometría

- Análisis de precipitinas

Características

- Mayor sensibilidad y exactitud - Uso en determinación de hormonas, péptidos, monitoreo de drogas

No competitivo

(IRMA) - Empleo de dos anticuerpos

Competitivo

-Detección de Hormonas -Detección de Drogas en el Suero -Detección de Anticuerpos Específicos -Detección de Agentes Tumorales

- Creado por Berson y Yallow (1956)

Homogéneos

- Aumento/disminución de la fluorescencia de haptenos - Inmunoanálisis por transferencia de excitación de la fluorescencia - Inmunoanálisis de protección de la fluorescencia - Inmunoanálisis de fluorescencia con sustrato marcado (SLFIA)

Heterogéneos

- Método indirecto (IFI) - Método competitivo - Método de sándwich - Método fluoroinmunométrico - PCFIA: Análisis inmunofluorométrico por partición radial

- Primer uso por Coons (1941)

Fluoróforos: compuestos orgánicos con estructura en anillo

Marcador estándar: FITC

Definicion y uso

Descrito en 1971 por Avrameas

Nombres alternativos: ELISA, EIA, EMIT

Usa enzimas como marcadores para detectar antígenos o anticuerpos

Clasificación

-Según el reactivo a determinar (antígeno o anticuerpo) - Según el reactivo marcado - Naturaleza competitiva o no del análisis - Método de separación de reactivos unidos o libres - Tipos: Heterogéneo y Homogéneo

Tipos

1.6.2 EIA Homogeneo

- No requiere separación de componentes libres y marcados - La reacción antígeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima

Enzimas más usadas

- Lisozima - Malato-deshidrogenasa - Glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa - Fosfolipasa-C - β-D-Galactosidasa

Otros EIA Homogéneos

- Análisis con grupo prostético marcado - Análisis con fosfolipasa C - Inmunoanálisis con refuerzo enzimático - Análisis con conjugado de avidina-antígeno y biotina - Análisis con donador enzimático clonado - Inmunoanálisis con modulador enzimático - Inmunoanálisis de canalización enzimática - Enzimoinmunoanálisis con liposomas

Co-factor enzimático marcado - Unión covalente de antígeno/producto con co-factor enzimático - Uso de NAD como co-factor

Variantes

Antígeno o analizado marcado enzimáticamente - EMIT (técnica de inmunoanálisis enzimático multiplicado) - Determinación de fármacos y hormonas

Sustrato enzimático marcado - Inmunoanálisis de fluorescencia (SLFIA) - Determinación de fármacos, haptenos, IgG e IgM

1.5. Métodos de inmunoanálisis: Clasificación

Inmunoanálisis de partículas

Prueba de Anti globulina (Coombs) - Detectar anticuerpos incompletos

Indirecta o pasiva - Aglutinación de células/partículas inertes recubiertas de antígenos o anticuerpos solubles

Pruebas de aglutinación de partículas - Directa - Aglomeración de células/suspensión de partículas insolubles

1.4 Principios generales de los inmunoanalisis

Clasificación

-Tipo II: Exceso de Analizado - Observación de distribución del analizado

- Tipo I: Exceso de Anticuerpo - Observación de distribución entre complejo y parte residual

Técnicas

- Detectar y cuantificar Antígenos y Anticuerpos - Reactivos marcados o sin marcar

1.3 Tipos de reacciones inmunologicas

Interacción Terciaria

- Activación del sistema del complemento - Opsonización - Fagocitosis - Quimiotaxis

Interacción Secundaria

- Precipitación - Floculación - Aglutinación - Fijación del complemento

Interacción Primaria

- Directa entre Antígeno y Anticuerpo

¿Que es ?

-Técnica de laboratorio -Detecta y cuantifica sustancias específicas

Funfamentos

-Basado en reacciones inmunológicas -Alta especificidad de unión entre antígeno y anticuerpo

Sustancias detectadas

-Proteínas -Hormonas -Anticuerpos