MÉTODOS DE INMUNOANÁLISIS

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Son técnicas empleadas para detectar y cuantificar antígenos y anticuerpos. Pueden emplearse reactivos marcados y sin marcar. Los métodos sin marcar tienen una baja sensibilidad ya que para su detección deben formarse grandes cantidades de complejo antígeno-anticuerpo.

MÉTODOS DE INMUNOANÁLISIS

CITOMETRÍA DE FLUJO

• A través de este método puede determinarse la estirpe celular, la etapa de maduración o el estado de activación que presenta una célula analizando la expresión de diferentes moléculas en su superficie o en su interior. Se realiza tiñendo las células con unas sondas marcadas con fluorescencia específica frente a esas moléculas y se mide la cantidad ligada por cada célula integrante de la población después de pasarlas de una en una, a través de un fluorímetro provisto de un haz incidente generado por láser

ENZIMOINMUNOANÁLISIS

• Este método fue descrito por primera vez en 1971 por Avrameas y los nombres más usados para este método son: ELISA, EIA, EMIT.

• Este método emplea una enzima como marcador para la detección de Antígenos o anticuerpos.

EIA HOMOGENEO

• El término puede ser aplicado a cualquier sistema de reacción antígeno- anticuerpo con el que sea posible medir el grado de reacción inmunológica sin separación de los componentes “libres” y marcados con anticuerpos. 

Las enzimas mas utilizadas son: - Lisozima - Malato- deshidrogenasa - Glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa - Fosfolipasa-C - β-D-Galactosidasa

Análisis con antígeno o analizado marcado enzimáticamente.

• La sustancia que hay que analizar se marca por unión covalente con la enzima y el anticuerpo frente al analizado determina la actividad de la enzima. 

Análisis con co-factor enzimático marcado

• Se lleva a cabo por la unión covalente de un antígeno o producto que hay que analizar con un cofactor enzimático y se evita que el anticuerpo se combine con la apoenzima adecuada. Se usa NAD como co-factor

Análisis con sustrato enzimático marcado

• Se marca por enlace covalente un sustrato enzimático con un producto que hay que analizar, de forma que la unión del sustrato y el anticuerpo inhiba estéricamente la enzima, impidiéndole actuar sobre el sustrato

EIA HETEROGENEO

• Fue descrito primeramente por Miles en 1968, quien describió el uso de anticuerpos marcados con isótopos en el RIA (Radio Inmuno Análisis) y sugirió que las enzimas podrían reemplazar el marcador isotópico. Fueron Engvall y Van Weemen en 1971 quienes informaron sobre el uso de los conjugados enzima- antígeno y enzimaanticuerpo en los Inmunoanálisis.

• Al EIA Heterogéneo pertenece el ELISA, el cual está basado en el mismo principio del RIA. En el ELISA, la actividad enzimática en la fracción unida y en la libre se cuantifica por la conversión de un producto catalizado por la enzima, incoloro o no fluorescente. El ELISA puede ser competitivo y no competitivo

Las enzimas mas utilizadas son: - Peroxidasa de rábano - Fosfatasa alcalina - β-D-Galactosidasa - Glucosa oxidasa - Glucoamilasa - Anhidrasa carbónica - Acetilcolinesterasa - Catalasa

ELISA NO COMPETITIVO

ELISA indirecto para medir el Anticuerpo

• En este se emplean antígenos inmovilizados que reaccionan con la muestra de anticuerpos, pasos de lavado y posterior reacción con anticuerpo marcado enzimáticamente y específico para la inmunoglobulina de la especie que se trata de analizar. 

ELISA tipo “sándwich”

• Se conoce también como análisis inmunoenzimométrico. Solo es aplicable a antígenos bivalentes o polivalentes. En esta, el anticuerpo inmovilizado en fase sólida se incuba con el antígeno estándar o de prueba 

ELISA COMPETITIVO

ELISA competitivo mediante conjugados de enzima-anticuerpo:

• El antígeno está unido a una fase sólida. La unión del anticuerpo marcado enzimáticamente y el antígeno en fase sólida disminuye competitivamente si se añade antígeno estándar o desconocido de prueba.

ELISA con empleo de antígeno marcado por una enzima

• Presenta un antígeno marcado enzimáticamente, con el anticuerpo específico inmovilizado en una fase sólida. Las concentraciones del producto sustrato son inversamente proporcionales a las del antígeno estándar o de prueba añadidos. 

INMUNOANÁLISIS DE PARTÍCULAS

• En estos análisis se emplean partículas tales como eritrocitos, armazones de látex y de poliglicilmetacrilato, sales de oro y sales de colorante en dispersión, como marcadores para el antígeno y el anticuerpo

PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN DE PARTÍCULAS

• La aglutinación es una reacción serológica clásica que implica la aglomeración de una suspensión celular por un anticuerpo específico.

• Las ventajas de la reacción de aglutinación son el alto grado de sensibilidad y la gran cantidad de antígenos que se pueden detectar mediante el uso de partículas recubiertas de antígeno o de anticuerpo.

Prueba de coombs

• Esta prueba fue descrita inicialmente por Moreschi en 1908 y redescubierta por Coombs y col en 1945 para demostrar la presencia de anticuerpos incompletos frente a los antígenos de los hematíes. Los Anticuerpos incompletos como la IgG anti- Rhᵒ no producen aglutinación en una suspensión salina de eritrocitos homólogos.

Prueba de aglutinación directa

• Es una reacción clásica que comporta la aglomeración de células o de una suspensión de partículas insolubles, como bacterias, hongos u otros organismos, mediante anticuerpos específicos. La agregación se produce por anticuerpos que poseen dos o más receptores de conjugación para fijar las células o partículas.

Pruebas de aglutinación indirecta o pasiva

• Implica la aglutinación de células o partículas inertes recubiertas de antígenos o anticuerpos solubles. Las células o partículas inertes son portadores pasivos y los antígenos pueden ser absorbidos físicamente o acoplados covalentemente a la superficie. Pueden emplearse hematíes humanos o partículas inertes como: Bentonita, látex, colodión y carbón vegetal.

FLUORO INMUNOANÁLISIS

• uso de los compuestos fluorescentes como marcadores inmuquímicos destinados a detectar los antígenos en cortes de tejidos. La mayoría de fluoróforos o compuestos fluorescentes, son compuestos orgánicos con estructura en anillo. Cuando una molécula de esta clase se irradia con luz de longitud de onda adecuada, quedan excitados los electrones dentro de la molécula y cambian hacia un estado de mayor energía. 

HOMOGENEOS

Realizados con instrumentación estándar (punto final o mediciones cinéticas), presentando las siguientes características:

• a. Aumento o disminución de la fluorescencia de los haptenos por el anticuerpo
• b. Inmunoanálisis por transferencia de excitación de la fluorescencia: marcado antigénico directo e indirecto.
• c. Inmunoanálisis de protección de la fluorescencia
• d. Inmunoanálisis de fluorescencia con sustrato marcado (SLFIA).

HETEROGENEOS

FIA en fase sólida, los que se clasifican de la siguiente manera:

• a. Método indirecto (IFI)
• b. Método competitivo
• c. Método de sándwich
• d. Método fluoroinmunométrico -

Inmunoanálisis de fluorescencia por concentración de partículas (PCFIA), al que pertenece el: - Análisis inmunofluorométrico por partición radial.

RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA)

• El RIA es el método más sensible entre todos aquellos que emplean un Antígeno o Anticuerpo marcado.

constituye un método típico de radioanálisis que depende de la É reacción antígeno-ant¡cuerpo que tiene lugar entre la sustancia que se ha de medir y los anticuerpos presentes en un antisuero 

NO COMPETITIVO

• Conocido como análisis inmuno radiométricos (IRMA) o tipo sándwich y aquí se emplea un exceso de anticuerpo. Otra característica es el empleo de dos anticuerpos dirigidos hacia sitios diferentes de la sustancia problema: de “dos sitios”. El RIA presenta mayor sensibilidad y exactitud que otros métodos descritos anteriormente. Se emplea para la determinación de todo tipo de hormonas, péptidos y el monitoreo de drogas terapéuticas (MDT).

COMPETITIVO

• Sigue las leyes de acción de masas, que especifica las relaciones entre la sustancia problema y las proteínas de unión, el anticuerpo o el receptor.

INMUNOANÁLISIS DE PRECIPITACIÓN

• También denominado análisis de precipitinas y se forman precipitados cuando se combinan grandes cantidades de complejos antígeno-anticuerpo para formar un retículo insoluble.

INMUNOANÁLISIS NEFELOMETRICOS

• Se emplean dispositivos para la dispersión lumínica y la formación de inmunocomplejos se relacionan con el valor de dicha dispersión.

NEFELOMETRÍA

• Se define como la detección de la energía lumínica dispersa o reflejada hacia un detector que no se encuentra en el camino directo del haz luminoso. La nefelometría se hace adecuada para medir muestras cuya concentración de partículas es baja, lo que da lugar a una débil dispersión de luz.

WESTERN BLOT (WB)

• o Western blotting, también conocida como protein blotting o inmunoblotting, es una técnica utilizada para detectar proteínas en un sistema de reconocimiento basado en la interacción antígenoanticuerpo. 

TURBIDIMETRÍA

• Se define como una disminución de la claridad de la luz a causa de su reflexión, dispersión y absorción que ocasionan las partículas existentes en suspensión.

ELECTROINMUNIDIFUSIÓN DE DIMENSION SIMPLE

• Desarrollada por Laurell en los años 60 y emplea un gel de agar con el anticuerpo incorporado en este. La siembra de las muestras se realiza al borde de la placa en depresiones y a continuación se efectúa la electroforesis de las muestras en el agar. El efecto de la electroforesis es acelerar la migración de los especímenes que se deben analizar en el agar, los cuales forman líneas de precipitación con el anticuerpo intrínseco en una configuración que asemeja a un proyectil -

INMUNO PRECIPITACIÓN EN GELES

• Conocida como Inmunodifusión radial (IDR) y utilizada para cuantificar inmunoglobulinas y proteínas séricas. Se incorpora el anticuerpo en el agar que se vierte sobre una bandeja o placa de cristal. Luego se cortan unos discos en el agar y en ellos se coloca el material de experimentación. Después de un tiempo en el cual se da la difusión y anillos de precipitación alrededor de los discos, se traza gráficamente una curva estándar midiendo los diámetros o áreas de los anillos de precipitación para los diferentes estándares de precipitación.