2/3. Как подручными реагентами выделить белки с различными свойствами из одного биологи?

Летняя практика МБФ

Евгения Евгеньевнаにより

Предмет, задачи и виды анализа

Григорьева Анастасияにより

Место пребывания рассекречено

Lesya Cherevkovaにより

Дайджест - Волонтерское движение

Татьяна Блиноваにより

последовательное выделение

основано на классической методологии Осборна

альбумины

Белки, очень легко растворимые в воде

Экстрагируются дистиллированной водой

глобулины

Большая группа белков, которые требуют определенного уровня ионной силы для растворения

Обычно экстрагируются 5-10% растворами нейтральных солей

проламины

Группа относительно гидрофобных белков

Экстрагируются водно-спиртовыми растворами

глиадины / глютелины

Белки, растворимые только в щелочных растворах

4 фракции белков

муку в качестве источника белков

не требуется разрушения клеток!

Статьи для чтения

Frolov e.a., 2018

Frolov A., Mamontova T., Ihling C., Lukasheva E., Bankin M., Chantseva V., Vikhnina M., Soboleva A., Shumilina J., Mavropolo-Stolyarenko G., Grishina T., Osmolovskaya N., Zhukov V., Hoehenwarter W., Sinz A., Tikhononovich I., Wessjohann L., Bilova T., Smolikova G., Medvedev S. Mining seed proteome: from protein dynamics to modification profiles. Biol. Commun. 2018; 63(1): 43–58. https://doi.org/10.21638/spbu03.2018.106

Лабораторная работа 2/3

оформление результатов

Выполняется внеаудиторно. Загружается дистанционно для оценки преподавателем с использованием выбранного формата интерактивного общения (LMS, облачное файлохранилище, социальные сети, онлайн-сервисы организации совместной работы и т.д.).

2/3 - описательное

В свободной форме, отражающей:

цель экспериментов,
проверяемая научная гипотеза (формулируется самими студентами);
протоколы выполнения экспериментов;
пошаговые иллюстрации выполнения протокола в виде фото- или видеофайлов;
результаты определения общего содержания белка в финальных препаратах;
сравнить результаты количественного определения белка и результаты анализа спектра белков после электрофореза в различных экстрактов (в чем отличия между выделенными препаратами различных классов белков?);
сравнить белковые спектры различных видов муки (требует взаимодействия между студентами из различных подгрупп);
общий вывод с указанием, достигнута ли цель эксперимента.

Результаты оформляются после занятия 3, на котором студенты получают результаты электрофореза полученных препаратов белков.

лабораторные протоколы

2/3. Выделение фракций белков из муки

Протокол выполнения опыта

Примерные источники белков: мука различных видов пищевых растений - пшеничная, рисовая, ржаная, кукурузная, гречишная, гороховая, овсяная и т.п.

Каждая подгруппа выполняет выделение из определенного вида муки. Учет результатов потребует сравнительного анализа данных как для различных фракций из одного вида мука, так и для препаратов из различных видов муки.

Обязательные компоненты протокола

В четыре микроцентрифужных пробирки на 2 мл взвесьте по 160 мг муки;.
добавьте в каждую пробирку по 1,6 мл дистиллированной или деионизированной воды;
инкубируйте 20 мин при температуре 37°C;
осадите частицы муки использую любую подходящую самодельную центрифугу из протестированных в лабораторной работе 2/2; при использовании ручных центрифуг скорость вращения должна быть максимальной из возможных,для центрифуги с гравером - 5-10 тысяч об/мин; время центрифугирования 5 минут;
если надосадочная жидкость после центрифугирования стала прозрачной - отберите её из всех микроцентрифужных пробирок и слейте в чистую пробирку на 10-15 мл - вы получили препарат альбуминов;
если надосадочная жидкость еще мутная - повторите операцию 4;
к осадкам муки в каждую микропробирку добавьте по 1,6 мл 5% раствора NaCl;
повторите операции 3-5 для получения препарата глобулинов, соберите его в новую пробирку;
к осадкам муки в каждую микропробирку добавьте по 1,6 мл 60% водного изопропанола;
повторите операции 3-5 для получения препарата проламинов, соберите его в новую пробирку;
к осадкам муки в каждую микропробирку добавьте по 1,6 мл 5% раствора NaOH;
повторите операции 3-5 для получения препарата глиадинов/глютелинов, соберите его в новую пробирку;
Осадки муки после проведения всех этапов экстракции отбросьте.

После получения финальных препаратов 4 различных фракций белков из муки определенного вида следует провести определение суммарного содержания белков в каждой из фракций подходящим чувствительным методом - например, фотометрически по методу Лоури или Брэдфорд или флюориметрически на приборе Qubit 4 (Thermo Fischer) или MaxLife (МВМ-Диагностик, Россия). Могут быть использованы и другие подходящие методы, в зависимости от возможностей конкретного учебного заведения. Выбор аналитического метода осуществляет преподаватель, он же предоставляет студентам пропись аналитического протокола.

Затем каждый из финальных препаратов делится на две части, первая из которых передается преподавателю для электрофоретического анализа, а вторая - замораживается для последующего использования на других занятиях.

организация работы

Подготовительная часть (преподаватель + лаборант): подготовка необходимых материалов и оборудования.

Основная часть (студенты на занятии): работа ведется в подгруппах по 3-4 человека. Каждая подгруппа проводит выделение различных классов растительных белков из одного конкретного вида муки.

Последующая часть (преподаватель + лаборант): проведение электрофореза белковых препаратов, предоставленными студентами.

Важно! Поскольку студенты работают с разными условиями экспериментов преподавателю следует обеспечить студентам возможность ознакомиться с результатами друг друга. Делать это в ходе выполнения эксперимента или во время заключительного мини-коллоквиума занятия - выбор преподавателя.

Также важно! Образцы белков, полученные в ходе работы, используются в других последующих лабораторных работах, в частности, на занятии 15.

результаты обучения

вопросы для обсуждения

Какие свойства белков можно использоваться для организации их эффективного выделения из биологических образцов?
Какие классы белков по физико-химическим свойствам можно выделить у растений и животных?
Какими соединениями можно вызвать обратимое осаждение белков для их очистки от низкомолекулярных балластных веществ?

развиваемые навыки

владеть методами препаративной биохимии
оценивать эффективность выделения целевого продукта из биологического материала
работать в коллективе для формирования общего вывода, учитывающего результаты, полученные несколькими исследователями

Белки из растительных клеток

выделение требует разрушения прочной клеточной стенки

механически

потери белков

интенсивное механическое растирание может вызывать разрушение и денатурацию части белков, особенно, крупных

ферментами

дорого

эффективное разрушение растительной клеточной стенки требует совместной обработки целлюлазой и пектиназой

2019, Валерий Зайцев. Это произведение доступно по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial («Атрибуция — Некоммерческое использование») 4.0 Всемирная