5/3. Какими способами можно выявить микроорганизмы, гидролизующие целлюлозу?

Meer zoals dit

Гимназия №210 "Корифей"

door Ekaterina Go

Модульное обучение

door Roman Nikitin

Метрология, стандартизация, сертификация. Технические измерения

door Анатолий Ефимов

Международная активность студента

door Александра Тараканова

Для чтения

Reddy e.a., 2017

Reddy K.V., Vijayalashmi T., Ranjit P., Raju M.N. Characterization of Some Efficient Cellulase Producing Bacteria Isolated from Pulp and Paper Mill Effluent Contaminated Soil. Braz. arch. biol. technol. 2017; 60: e17160226. doi: 10.1590/1678-4324-2017160226

Johnsen, Krause, 2014

Johnsen H.R., Krause K. Cellulase activity screening using pure carboxymethylcellulose: application to soluble cellulolytic samples and to plant tissue prints. Int. J. Mol. Sci. 2014; 15(1): 830-838. doi: 10.3390/ijms15010830

Islam, Roy, 2018

Islam F., Roy N. Screening, purification and characterization of cellulase from cellulase producing bacteria in molasses. BMC Res. Notes. 2018; 11(1): 445. doi: 10.1186/s13104-018-3558-4

Лабораторная работа 5/3

оформление результатов

для всех протоколов - количественное

В свободной форме, содержащей:

1. рабочие протоколы выполнения работы,
2. фотографии поэтапного выполнения протоколов.
3. количественные результаты определения целлюлазной активности различными методами

лабораторные протоколы

5/3 б. Определение целлюлазной активности в жидкой среде

Протокол выполнения опыта

1. для выполнения задания получите у преподавателя раствор целлюлазы;
2. разлейте в 2 пробирки по 100 мкл раствора целлюлазы и по 1 мл 1 М цитратного буферного раствора, рН 5,5;
3. в одну из пробирок добавьте 1 мл 1% раствора КМЦ в 1 М цитратном буферном растворе, рН 5,5;
4. в другую пробирку поместите 5 полосок фильтровальной бумаги размером 0,1 на 1 см;
5. инкубируйте пробирки 1 час при температуре 45°С;
6. после окончания инкубации прокипятите пробирки в течение 10 мин и охладите под проточной водой;
7. из каждой пробирки возьмите по аликвоте реакционной среды и измерьте содержание глюкозы с использованием коммерческого набора реактивов для определения глюкозы (выполняется по инструкции производителя);
8. из каждой пробирки возьмите по аликвоте реакционной среды и измерьте содержание глюкозы с помощью бытового глюкометра (выполняется по инструкции производителя).

5/3 а. Определение целлюлазной активности по размеру зон деградации целлюлозы

Протокол выполнения опыта

1. получите у лаборанта чашки Петри, инокулированные образцами почвы при выполнении протоколов 4/3 а и 4/3 б;
2. залейте агар в чашках 0,1% раствором конго красного и инкубировать 20 мин при комнатной температуре;
3. слейте краситель;
4. промойте агар 1% раствором NaCl;
5. измерьте диаметры бактериальных колоний и диаметры зон деградации целлюлозы;
6. определите для каждой колонии целлюлозолитический индекс, который представляет собой разность между диаметром зоны деградации и диаметром колонии.

организация работы

Подготовительная часть (преподаватель + лаборант): подготовка необходимых материалов и оборудования.

Подготовительная часть (лаборант): подготовка раствора целлюлазы для выполнения протокола 4/3 б.

Основная часть (студенты на занятии): работа выполняется в тех же подгруппах, что и работа 4/3.

Важно! Поскольку студенты работают с разными условиями экспериментов преподавателю следует обеспечить студентам возможность ознакомиться с результатами друг друга. Делать это в ходе выполнения эксперимента или во время заключительного мини-коллоквиума занятия - выбор преподавателя.

результаты обучения

вопросы для обсуждения

1. Какие вещества или материалы могут служить субстратами для скрининга микроорганизмов на наличие целлюлолитической активности в жидких и твердых средах?
2. Чем определяется субстратная специфичность бактериальных целлюлаз?
3. Какое практическое значение может иметь применение целлюлаз в биотехнологии?

развиваемые навыки

• приготовление микробиологических питательных сред
• обнаружение внеклеточных ферментов микроорганизмов

Способы оценки целлюлолитической активности

в жидкой фазе

его можно приготовить из доступных компонентов?

КМЦ-агар домашний

В составе КМЦ-агара при домашнем приготовлении можно использовать порошок КМЦ, продающийся в качестве пищевой добавки Е466. Желатин можно использовать пищевой. Также пищевой агар-агар (желирующий агент в кулинарии) можно взять вместо микробиологического агара. Краситель исключается, а соли в РФ легко купить в одном из интернет-магазинов химических реактивов.

Один из вариантов КМЦ-агара можно приготовить так. В 900 мл теплой воды добавить 0,5 г KH₂PO₄ и 0,5 г MgSO₄х7H₂O, размешать до полного растворения, проверить величину рН (например, ручным рН-метром или рН-метром для аквариума), если необходимо - довести рН до величины 7,0 раствором щелочи (можно использовать, например, самые дешевые средства для промывки канализационных труб - они обычно представляют собой просто раствор NaOH в воде). После этого добавить 10 г КМЦ, размешать до полного растворения при умеренном нагревании. Затем добавить 12 г агар-агара и нагревать на водяной бане до полного растворения. После получения раствора без комочков останется стерилизовать среду любым подходящим способом и разлить её (пока она еще горячая) в чашки Петри или другую подходящую посуду, которую вы соберетесь использовать для выращивания микроорганизмов (разливать в стерильных условиях!).

как результат роста на твердых средах

МКЦ-агар по домашнему рецепту готовится так же, как и КМЦ-агар, но КМЦ заменяется на порошок микрокристаллической целлюлозы (МКЦ), который может быть приобретен как пищевая добавка E460i или получен из соответствующих БАД (лучше из капсул или из таблеток, не содержащих солей стеариновой кислоты)

на твердых средах

на специальной среде

Более надежные результаты получаются, если целлюлолитические микроорганизмы высаживаются на гель из чистой КМЦ

на типовой питательной среде

В этом случае микроорганизмы выращиваются на твердой среде, содержащей природную или модифицированную целлюлозу. После окончания инкубации зоны разрушения целлюлозы учитывают визуально. Для улучшения распознавания границы деградации среду дополнительно прокрашивают красителями, например, конго красным

2019, Валерий Зайцев. Это произведение доступно по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial («Атрибуция — Некоммерческое использование») 4.0 Всемирная

5/3. Какими способами можно выявить микроорганизмы, гидролизующие целлюлозу?