av Георгий Просекин 9 år siden
1103
TALEN
Белки TALE играют важную роль в связывании с ДНК и активации транскрипции целевых генов. Каждый их мономер связывается с отдельным нуклеотидом, что обеспечивает специфичность взаимодействия.
av Георгий Просекин 9 år siden
1103
Mer som dette
Для направленной активации экспрессии генов используются конструкции, содержащие ДНК-связывающий домен TALE и синтетический доменVP64 – TALE-TF.
Попадая в ядро, химерный белок связывается с целевой нуклеотидной последовательностью, домен VP64 привлекает эндогенные активаторы экспрессии генов. При этом значимо увеличивается экспрессия целевого гена, что обычно подтверждают с помощью ПЦР в реальном времени. Возможна также активация не-кодирующих генов, например генов микроРНК .Подавление экспрессии целевого гена может достигаться при использовании химерных белков, содержащих домены KRAB или SRDX .
Экспансия тринуклеотидных повторов GAA в этом гене приводит к развитию атаксии Фридрейха, при этом структура белка не меняется, однако снижается его экспрессия.Показано, что с помощью TALE-TF можно повыситьэкспрессию гена FXN в фибробластах человека, несмотря на увеличенное число тринуклеотидных повторов
1. различия в эффективности связывания RVD и специфических нуклеотидов
2. из-за вырожденности кода связывания нуклеотидов
3. возможна димеризация доменов FokI двух нуклеаз с одинаковыми ДНК-связывающимидоменами
4. размер спейсерной ДНК между сайтами узнавания нуклеаз не фиксирован
подтема
История разработки этой системы связана с изучением бактерий рода Xanthomonas. Эти бактерии являются патогенами таких культурных растений,как рис, перец, томат, они наносят экономически значимый вред сельскому хозяйству, что стало причиной их тщательного изучения.
Нуклеаза делает в сайте-мишени двухцепочечные разрывы, которые репарируются в клетке по одному из двух возможных механизмов
Редактирование геномов растений с помощью системы TALEN к настоящему времени проведено на четырех модельных объектах. Примером растения, которое приобрело новые свойства в результате редактирования генома системой TALEN, служит рис, устойчивый к патогену Xanthomonas oryzaepv.
Так с помощью TALEN s можно модифици- ровать ген C-C рецептора хемокина 5 T-лимфоцитов, мутации в котором делают человека невосприимчи- вым к ВИЧ
карочиря ище с муковисцидозом
это событие происходит в клетке довольно редко, но использование TALENs позволяет повысить вероятность прохождения гомологичной рекомбинации на несколько порядков.
ДНК-связывающий домен состоит из мономеров,каждый из которых связывается с одним нуклеотидом в целевой нуклеотидной последовательности.Мономеры представляют собой тандемные повторы из 34 аминокислотных остатков, из которых два, расположенные в позициях 12 и 13, высоко вариабельные (Repeat Variable Diresidue, RVD), и именно они отвечают за узнавание определенного нуклеотида.
В большинстве работ используют мономеры, содержащие RVDAsn и Ile (NI), Asn и Gly (NG), два Asn (NN), His и Asp(HD)
После расшифровки кода узнавания ДНК белками TALE, который привлек внимание ученых всего мира благодаря своей простоте (один мономер – один нуклеотид), были проведены первые работы по созданию химерных нуклеаз TALENs.
С этой целью последовательность, кодирующая ДНК-связывающийдомен TALE, встроили в плазмидный вектор, использованный ранее при создании ZFN
Впервые способностьэтих белков связываться с ДНК была описана в 2007 году, а всего через год двумя группами ученых был расшифрован код узнавания целевой последовательности ДНК белками TALE
Все началось в 1972 году в лаборатории Пола Берга, когда ученые объединили геном кишечной палочки с генами бактериофага и вируса SV40.
В 1996 году было впервые показано, что белковый домен типа «цинковые пальцы», соединенный с FokI-эндонуклеазным доменом, действуеткак сайт-специфическая нуклеаза, разрезая ДНК in vitro в строго определенных участках
Transcription Activator-Like Effector Nucleases
(эффекторные нуклеазы, подобные активаторамтранскрипции)
Такая системы, активно применяемая для различных манипуляций с геномами, позволяет решать сложные задачи,включая получение мутантных и трансгенных растений и животных, создание и исследование моделей заболеваний на основе культивируемых плюрипотентных клеток человека.
Кроме того, химерные белки на основе ДНК-связывающих доменов TALE используют в экспериментах по регуляции транскрипции генов,для изучения эпигеномов и поведения хромосомных локусов в клеточном цикле.
