Extensión de sangre periférica teñida con May Grünwald - Giemsa
ESTUDIO MORFOLÓGICO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS EN SANGRE PERIFÉRICA Y MÉDULA OSEA
- Se realiza en la sección de citología del laboratorio de hematología.
- Permite calcular la proporción de los distintos tipos celulares normales presentes en ambos tipos de muestras y detectar la presencia de tipos celulares anómalos.
AUTOMATIZACIÓN DE LAS TINCIONES HEMATOLÓGICAS
En la actualidad existen en el mercado multitud de teñidores automáticos, controlados por microprocesadores y basados en brazos robotizados, que lo mismo transportan cestillos con las preparaciones y los sumergen en cubetas con los colorantes, que pipetean y dispensan los reactivos secuencialmente sobre las extensiones colocadas en soportes horizontales. Un tipo especial son los inmunoteñidores, adaptados para la realización de técnicas de inmunocitoquímica.
En los sistemas automáticos globales más modernos, un software selecciona las muestras de sangre periférica que requieren un estudio morfológico microscópico, realiza las extensiones mediante un extensor, las tiñe, escanea las preparaciones con un sistema de visualización microscópica y calcula la fórmula leucocitaria mediante un software experto de análisis de imagen.
Sistemas automáticos globales
Cálculo de la fórmula leucocitaria
Escaneo de preparaciones con sistema de visualización microscópica
Realización de extensiones
Selección de muestras
MÉDULA OSEA
Se evaluan aspectos como:
- Leucopoyesis: se evalúan la morfología y el estado de los elementos mieloides y linfoides, los tipos de maduración, el predominio de alguna serie o tipo celular y la presencia de formas anormales.
- Eritropoyesis: se analiza la proporción relativa de los distintos elementos de la serie roja, las formas de maduración y la presencia de elementos anormales.
- Trombopoyesis: se evalúa el número y estado funcional de los megacariocitos y la morfología de las plaquetas.
- Sistema retículo-endotelial: se analiza la morfología de los elementos reticulares y de las células plasmáticas.
- Elementos anormales: se valora la presencia de células neoplásicas metastásicas, reacciones granulomatosas, fenómenos tesaurismóticos, parásitos, etc.
Examen a gran aumento (100x)
Realizar el mielograma
- Recuento diferencial de los elementos que componen la celularidad medular, expresándose porcentualmente la proporción de cada tipo celular.
- Debido a la gran variedad de células y su distribución irregular en la extensión, es preciso contar, como mínimo, 300 células para que los resultados sean precisos.
Analizar las alteraciones
Examen a bajo aumento (10x y 40x)
Parámetros:
- Presencia de grumo: si es inexistente, no es valorable
- Celularidad global: se valora entre 1 y 4, normal > 3
- Relación mieloeritroide: proporción entre el número de células de la serie mieloide y el de la serie eritroide. Normal de 3 a 1.
- Cantidad de grasa: vacuolas redondeadas sin teñir en el seno del grumo.
- Alteraciones estromales: como fibrosis, necrosis o transformación gelatinosa, que aconsejan realizar estudio anatomopatológico de biopsia ósea.
- Presencia de algunos tipos celulares medulares: como megacariocitos, mastocitos, células plasmáticas, osteoclastos y osteoblastos.
- Presencia de elementos celulares extramedulares: sobre todo células metastásicas.
- Presencia de parásitos: como las filarias.
Tinción
Necesarias debido a similitudes morfológicas. Además mejoran la diferenciación celular.
Detectan:
- Actividad enzimática
- Principios inmediatos
- Elementos inorgánicos
- Moléculas relevantes en diagnóstico y seguimiento de hemopatías
Inmunocitoquímicas
Se basan en la utilización de anticuerpos específicos para detectar moléculas (marcadores) que caracterizan poblaciones celulares concretas.
Es un método sencillo y potente de identificación de poblaciones celulares.
Requiere de un sistema de visualización basado en marcadores de fluorocromos y enzimas (peroxidasa y fosfatasa alcalina).
Se aplica en la identificación y clasificación de células neoplásicas.
Evidencia
Precipitado coloreado en las zonas con Ag
- Si se usa peroxidasa y diaminobencidina se obtiene una coloración marrón
- Si se usa fosfatasa alcalina y fast red se obtiene una coloración rojiza.
Procedimientos de acoplamiento del marcador al complejo Ag-Ac
Uso de polímeros sintéticos
Sistema biotina-estreptavidina
Citoquímicas
Se basan en reacciones químicas sencillas que originan productos coloreados y que ponen de manifiesto determinados componentes celulares.
Fosfatasa ácida
- EZ que hidroliza monoésteres del ácido fosfórico a pH ácido
- Los resultados dependen de la sal diazoica utilizada. Cuando se usa pararrosa-anilina, en el citoplasma de las células positivas se observa un precipitado rojo/anaranjado.
- Útil en la identificación de leucemia de células vellosas
Esterasas
- Las esterasas son enzimas que hidrolizan ésteres. Existen varias enzimas con actividad esterasa que se diferencian unas de otras por su capacidad para hidrolizar sustratos diferentes.
- Los resultados dependen de la sal diazoica utilizada. Cuando se usa pararrosa-anilina, en el citoplasma de las células positivas se observa un precipitado rojo/anaranjado-pardo de intensidad variable, difuso o focal, dependiendo del tipo celular.
- Los distintos tipos celulares encontrados en una médula ósea tienen distintos patrones de actividad esterasa, por lo que la combinación de las tres tinciones, junto con estudios de inhibición de la actividad con sustancias como el fluoruro sódico, permite distinguir entre precursores morfológicamente similares. En este sentido son especialmente útiles en el diagnóstico de leucemias agudas
Mieloperoxidasa (MPO)
- La mieloperoxidasa es una enzima sintetizada en el retículo endoplasmático rugoso de las células mieloides, de donde pasa a las cisternas del aparato de Golgi, quedando localizada, fundamentalmente, en la granulación primaria azurófila.
- La reacción enzimática tiñe de marrón los gránulos citoplasmáticos de neutrófilos, eosinófilos y monocitos, por su contenido en peroxidasa.
- La aplicación fundamental de la MPO se refiere a su capacidad discriminatoria entre celularidad blástica mieloide (MPO positiva) y linfoide (MPO negativa).
PAS
- La tinción de PAS (ácido peryódico-Schiff) se utiliza para poner de manifiesto glucógeno y mucopolisacáridos.
- La reacción colorea de rojo púrpura intenso los mucopolisacáridos, glucógeno y mucoproteínas neutras y de rosa pálido las glicoproteínas. Los núcleos suelen teñirse de azul por la coloración de contraste.
- Es especialmente útil en el diagnóstico de la leucemia linfoblástica aguda y de la eritroleucemia.
de Pearls para hierro
- La tinción de Perls o azul de Prusia se utiliza para poner de manifiesto la presencia de hierro iónico intracelular y más concretamente la hemosiderina.
- Se observan depósitos azul turquesa en el citoplasma de las células que contienen hierro.
- La valoración del hierro macrofágico da una idea de los depósitos de hierro del organismo
- La tinción de Perls se puede realizar también sobre extensiones de sangre periférica para poner de manifiesto los siderocitos o hematíes con depósitos de hierro (< 1% en frotis normales).
Tiempos más largos de incubación con colorantes, ya que las extensiones medulares tienen un mayor grosor.
Con estas tinciones, el tejido conectivo y la matriz extracelular presente en el grumo se tiñen de color azul oscuro o púrpura. Las demás estructuras celulares se tiñen igual que en los frotis de sangre periférica.
De estructuras del grumo
Azul oscuro o púrpura
May Grunwald-Giemsa
Consiste en una capa fina de un aspirado de médula ósea dispuesta sobre un portaobjetos para realizar un análisis morfológico de sus células con ayuda de un microscopio y, a menudo, de tinciones.
- Permite el análisis morfológico de células hematopoyéticas
- Aplicaciones en el estudio de enfermedades hematológicas y algunas no hematológicas (metátasis de tumores, enfermedades por acúmulo - Enfermedad de Gaucher - y enfermedades infecciosas o parasitarias - tuberculosis y leishmaniosis -)
Obtención
Extensiones MO
Preparación
Cuando el grumo es muy escaso o solo disponemos de sangre medular.
Por aplastamiento
Procedimiento
- Colocar un pequeño volumen de aspirado medular que contenga grumo en un portaobjetos limpio, próximo a uno de sus extremos.
- Apoyar suavemente otro portaobjetos limpio sobre el anterior, de manera que el grumo se aplaste ligeramente. Los portaobjetos se colocan de manera que queden libres extremos opuestos de ambos.
- Sujetar los extremos libres de los portaobjetos, cada uno con una mano, y deslizar uno sobre otro, de manera que el material aplastado se extienda sobre el portaobjetos en forma ovoide.
- Dejar secar la extensión al aire.
En este procedimiento, el factor que más influye en la calidad de la extensión es la presión ejercida al deslizar un portaobjetos sobre el otro. Debe ser suficiente para aplastar el grumo y hacer que todo el material se extienda uniformemente sobre el portaobjetos, pero no excesiva para evitar que se rompan las células.
Con grumo
Junto con la sangre sinusal.
Procesado del aspirado de MO
Anticoagulación con EDTA
Para la realización de estudios celulares complementarios.
Inmediatamente tras la extracción
Aspirado de médula ósea
- En huesos que conservan la hematopoyesis: cresta iliaca posterior superior, anterior y del esternón. En niños en tibia
- Basta con 0,5 ml de aspirado, pero a veces más de 5 ml
Sangre medular (senos venosos)
Procedente de la vascularización de la médula. Se habla también de sangre sinusal.
En determinadas ocasiones es imposible obtener grumo o sangre medular al practicar un aspirado medular. Esta circunstancia recibe el nombre de «punción blanca» o «punción seca».
Sin embargo, esta circunstancia no indica que la médula sea hipocelular, por lo que en estos casos está indicado realizar una biopsia.
Grumo medular
Material propio de la médula ósea
Matriz extracelular
En proporción variable.
Grasas
Células
Células hematopoyéticas y estromales del tejido conectivo.
CRITERIOS MORFOLÓGICOS
Características citoplasmáticas
- Cantidad
- Propiedades tintoriales
- Presencia/ausencia de gránulos
- Aspecto, tamaño y propiedades tintoriales de los gránulos
Características nucleares
- Aspecto de la cromatina
- Número y aspecto de los nucleólos
Presencia/Ausencia de núcleo
Forma y Tamaño
SANGRE PERIFÉRICA
Examen Microscópico
- Imprescindible en el diagnóstico hematológico
- Permite detectar y confirmar alteraciones cuantitativas y/o morfológicas de eritrocitos, leucocitos y plaquetas
- Sus indicaciones son el hemograma con desviación significativa en los recuentos directos, indirectos o calculados, la sospecha clínica de enfermedad hematológica y la sospecha clínica de enfermedad de origen no hematológico con manifestaciones hematológicas (enfermedades parasitarias o infecciosas, tratamientos oncológicos...), aunque los parametros del recuento estén dentro de los rangos esperados por edad y sexo
Examen a 100x
- El examen más exhaustivo de la extensión sanguínea
- Si el área que se examina es la correcta, en cada campo se observan alrededor de 200-250 hematíes sin que apenas contacten unos con otros
- En este examen a gran aumento se analizan las tres series: leucocitos, eritrocitos y plaquetas.
Evaluación de plaquetas
- Estimación del recuento de plaquetas/mm3. Para hacerla se cuentan las plaquetas presentes en 10 campos en los que los hematíes no se toquen, se calcula el promedio por campo y se multiplica por 20.000
- Detección de agregados plaquetarios, fundamental para distinguir auténticas trombopenias de las pseudotrombopenias, en las que el recuento automático es bajo por la presencia de dichos agregados
Evaluación de eritrocitos
- Detección y recuento de eritroblastos (hematíes nucleados). El resultado cuantitativo se expresa como número de eritroblastos por cada 100 leucocitos
- Análisis morfológico de los eritrocitos para detectar posibles inclusiones (cuerpos de Howell-Jolly, punteado basófilo) y/o formas anómalas (hematíes falciformes, esquistocitos, dianocitos, acantocitos...), importantes en el diagnóstico de algunas patologías
Evaluación de leucocitos
- Recuento diferencial de leucocitos o formula leucocitaria, que implica el recuento de 100 leucocitos para expresar en % la proporción de los distintos tipos de leucocitos presentes en la extensión, incluyendo, si es el caso, las células inmaduras o blastos
- Análisis morfológico de los leucocitos para detectar cualquier alteración (cuerpos de Döhle, Bastones de Auer, Linfocitos reactivos, Disgranulopoyesis)
Examen a 40x
Se localiza una zona del cuerpo del frotis en la que los hematíes se distribuyan uniformemente sin que apenas se toquen los unos con otros.
Recuento de leucocitos/mm3
Procedimiento:
- Se cuentan los leucocitos presentes en 10 campos de 40x de la zona seleccionada.
- Se calcula la media de leucocitos por campo y se multiplica por 2.000.
Esta aproximación sirve de control de calidad para detectar discrepancias con el recuento automático.
Examen a 10x
Distribución adecuada de leucocitos
En concreto, la presencia de acúmulos de células nucleadas grandes (monocitos, neutrófilos) en la cola y los bordes, el cual es criterio suficiente para repetir la extensión.
Calidad general del frotis
Células grandes anormales
Como blastos.
Aglutinaciones de leucocitos
Plaquetas y hematíes, así como apilamiento de hematíes (rouleaux).
Presencia de parásitos
Como filarias.
Tinción Hematológica
Especial
Permiten detectar actividades enzimáticas, principios inmediatos, elementos inorgánicos o moléculas específicas de utilidad en el diagnóstico y seguimiento de hemopatías.
Más habituales en extensiones de médula osea.
Fosfatasa Alcalina Granulocítica
- Útil en extensiones de sangre periférica
- Detecta actividad enzimática en los gránulos secundarios de leucocitos neutrófilos
- Se emplea para el estudio de síndromes mieloproliferativos
Convencional
Tinciones que se realizan para colorear las diversas estructuras de las células sanguíneas, aumentando así el contraste entre ellas y el medio que las rodea, y facilitando la identificación de los diferentes tipos celulares al microscopio.
Supravitales
Diseñadas para la observación de células vivas, no requiriendo una fijación previa.
En este tipo de tinciones, primero se realiza la tinción, mezclando el colorante con la sangre, y después se realiza la extensión sobre el portaobjetos para visualizarla al microscopio.
Azul Cresil Brillante
Para reticulocitos (hematíes inmaduros), que aún conservan algunos orgánulos celulares (ribosomas, mitocondrias) y restos de ARN.
Procedimiento
El procedimiento se realiza en tres pasos:
- Introducir en un tubo de hemólisis cantidades iguales (por ejemplo, 3 gotas) de la solución colorante y de sangre periférica anticoagulada con EDTA. Mezclar suavemente y cerrar el tubo con parafilm para evitar la desecación.
- Incubar cinco minutos en baño María a 37 ºC.
- Homogeneizar suavemente la mezcla, depositar una gota sobre un portaobjetos limpio y realizar una extensión, que se deja secar al aire.
Con esta tinción, los hematíes se tiñen de color verde pálido y los reticulocitos se diferencian porque en su interior se observan estructuras granulares y/o filamentosas de color azul.
Policromas
Utilizan combinaciones de colorantes con distintas afinidades para que las estructuras celulares se tiñan con colores diferentes.
- Se aplican sobre células muertas
- Se requiere fijación previa (para evitar alteraciones de la estructura celular y facilitar la adherencia al portaobjetos)
- Tinciones derivadas de la Tinción Romanowsky: Azul de Metileno y Eosina
Panóptica rápida
- Muy utilizada en laboratorios de urgencias
- Combina las técnicas anteriores para conseguir mayor rapidez
- Utiliza tres reactivos: solución fijadora, colorante ácido tamponado y colorante básico tamponado
- Incubaciones por inmersión secuencial
Procedimiento
A diferencia de las técnicas anteriores, las incubaciones se realizan por inmersión secuencial. Es necesario, por tanto, preparar tres cubetas de tinción con los tres reactivos y sumergir la extensión primero en la de solución fijadora, luego en la de colorante ácido tamponado y finalmente en la de colorante básico tamponado.
Cada inmersión debe durar solo 5-10 segundos (también se pueden hacer varias inmersiones de un segundo cada una) y no es necesario realizar lavados intermedios entre una y otra, basta con escurrir el exceso de cada reactivo sobre papel de filtro.
Wright
- Habitual
- Un único colorante que combina Eosina, Azul de Metileno y derivados de este último en metanol
- Consta de dos pasos
Procedimiento
La tinción se realiza con un colorante pero en dos pasos. Primero se incuba con el colorante sin diluir, y luego con una dilución tamponada del mismo colorante.
Los pasos que se deben seguir son estos:
- Colocar la extensión en un puente de tinción sobre un cristalizador o un fregadero.
- Cubrir la extensión con colorante de Wright sin diluir durante 5-8 minutos. El metanol fija la extensión y se inicia la tinción de las células.
- Volcar la extensión para eliminar el colorante y escurrir.
- Cubrir la extensión con una dilución del colorante de Wright en tampón de pH 7,2 durante unos 10-15 minutos. En esta fase se completa la tinción de las estructuras celulares.
- Volcar la extensión para eliminar el colorante, lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire.
May Grünwald-Giemsa
- Muy utilizada en hematología
- Se ioniza en solución acuosa
- El colorante de May Grünwald actúa como fijador
- Se combinan con los distintos componentes celulares
- Generan sales insolubles de distintos colores
May Grünwald: es una solución de eosina y azul de metileno en metanol, que actúa como fijador.
El azul de metileno es un colorante básico (catiónico) con afinidad por los componentes celulares ácidos, como los ácidos nucleicos, a los que tiñe de azul. Las estructuras celulares que fijan colorantes básicos se denominan basófilas.
Giemsa: es una mezcla de eosina y derivados del azul de metileno, como el azur I y el azur II.
La eosina es un colorante ácido (aniónico) que tiñe de matices de rojo los componentes celulares básicos, como la hemoglobina y otras proteínas básicas y los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos eosinófilos. Las estructuras celulares que fijan colorantes ácidos se denominan acidófilas; y cuando el colorante que fijan es la eosina, se denominan eosinófilas.
En un frotis teñido adecuadamente con la técnica de May Grünwald-Giemsa, las estructuras celulares se tiñen de la siguiente forma:
- Eritrocitos: rosa-salmón.
- Núcleos de las células: azul oscuro-violeta.
- Gránulos citoplasmáticos de los leucocitos neutrófilos: azul claro-lila.
- Gránulos citoplasmáticos de los leucocitos basófilos: azul oscuro-negro.
- Gránulos citoplasmáticos de los leucocitos eosinófilos: rojo-anaranjado.
El área que hay entre las células debe estar limpia y sin precipitados.
Procedimiento
Normalmente se utilizan kits comerciales que contienen una solución concentrada de May Grünwald en metanol y una solución acuosa (tamponada o no) concentrada de Giemsa. Para realizar la tinción hay que diluir ambos colorantes teniendo en cuenta la concentración inicial de los reactivos, distinta en cada fabricante.
Una vez preparados los reactivos:
- Colocar la extensión en un puente de tinción sobre un cristalizador o un fregadero.
- Cubrir la extensión con solución de May Grünwald durante dos minutos (fijación).
- Volcar la extensión para eliminar el colorante y escurrir.
- Cubrir la extensión con solución diluida de May Grünwald durante un minuto.
- Volcar la extensión para eliminar el colorante, lavar con agua destilada y escurrir.
- Cubrir la extensión con solución diluida de Giemsa durante 20 minutos.
- Volcar la extensión para eliminar el colorante, lavar, escurrir y dejar secar al aire.
Extensión
Consiste en una capa fina de sangre dispuesta sobre un portaobjetos para realizar un análisis morfológico de sus células con ayuda de un microscopio y, a menudo, de tinciones.
Factores que influyen en la calidad de la extensión
Características y zonas
Zonas
Cola
Zona final de la extensión, más fina. Los hematíes se disponen de forma acordonada dejando huecos entre ellos y hay una mayor proporción de leucocitos grandes (granulocitos y monocitos) y plaquetas grandes. La cola termina en forma ligeramente redondeada con borde finamente deshilachado (barbas).
Cuerpo
Zona media del frotis. Los hematíes se disponen formando una sola capa y los leucocitos mantienen una proporción equilibrada. Es la zona ideal para realizar el estudio morfológico de las células.
Cabeza
Zona inicial, más gruesa. Los hematíes pueden estar formando más de una capa y hay más proporción de linfocitos.
Características
Disminución progresiva y continua del grosor
De principio a fin.
Bordes laterales visibles
Separados 1 mm de los bordes del portaobjetos
Lisas
Sin agujeros ni rayas.
Técnicas
Técnica del portaobjetos en cuña
Necesitamos dos portaobjetos de vidrio limpios de 7,5 x 2,5 cm con los bordes biselados, uno como soporte y otro como extensor.
La extensión se realiza de la siguiente manera:
- Depositar gota de sangre de 3 mm diámetro (10-15 µl) en el soporte, cerca de uno de los extremos
- Colocar extensor por delante de la gota de sangre formando cuña en un ángulo de 35-45º
- Deslizar el extensor un poco hacia atrás para que su borde entre en contacto con la gota de sangre, que se distribuye por capilaridad a lo largo del mismo
- Deslizar el extensor sobre toda la longitud del soporte en un movimiento rápido, suave y continuo, manteniendo el ángulo entre ambos y una presión homogénea. De esta forma la gota de sangre se distribuye uniformemente formando una monocapa de células que ocupa 2/3 o 3/4 de la longitud del soporte
- Dejar secar la extensión al aire
Vías de obtención de la sangre
Punción yema dedo
- Con lanceta
- Se obtiene sangre capilar
Venopunción
Se debe anticoagular con EDTA.
