MÉTODOS Y TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

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MÉTODOS Y TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

Selección de microorganismos productores de vitaminas y otros factores de crecimiento.

A escala industrial y de forma general se utilizan como microorganismos productores de aminoácidos a las bacterias y como microorganismos productores de vitaminas a los eucariotas (levaduras y hongos filamentosos). Esta premisa nos sirve de orientación para elegir los medios selectivos y de enriquecimiento para aislar inicialmente a los microorganismos productores, bacterias u hongos.

Necesitamos, al igual que para la detección de antibióticos, un microorganismo test que posea un requerimiento absoluto para el factor de crecimiento que nos interesa (auxótrofos). Estos microorganismos pueden ser bien mutantes naturales o mutantes provocados por la acción de agentes mutágenos. El screening se realiza de forma similar al de la producción de antibióticos, aunque en este caso al medio de cultivo le falta el factor de crecimiento buscado, de tal manera que el microorganismo test sólo crecerá alrededor de las colonias que produzcan este factor de crecimiento (halo de crecimiento).

Selección de microorganismos productores de antibióticos y otros agentes inhibidores del crecimiento.

Una vez crecidas las colonias que nos interesan, se utiliza un medio que contenga el microorganismo que sea susceptible de inhibirse su crecimiento por los antibióticos que queramos seleccionar: Gram +, Gram -, amplio espectro, etc. Se aislan, para ensayos posteriores, aquellas colonias que produzcan halos de inhibición.

Temperatura: Hongos 20-22°C; Actinomicetos 28°C pH: Hongos pH ácido; Bacterias pH neutro Oxígeno: Todos los productores son aerobios Carbono: Actinomicetos glicerol, quitina, almidón Nitrógeno: Actinomicetos caseina, arginina, asparragina; En general amonio o nitrato.

Los microorganismos productores de antibióticos se encuadran dentro de las bacterias (Bacillus, Pseudomonas y fundamentalmente actinomicetos) y hongos (Penicillium). Los parámetros que se utilizarían para seleccionar estos microorganismos productores de antibióticos serían:

SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS.

A este medio se le pueden añadir inhibidores para eliminar los que no nos interesan. Por ejemplo, si queremos obtener un microorganismo aerobio lo creceríamos en presencia de O2 con lo que los anaerobios no crecerían; o bien si queremos seleccionar hongos, añadiríamos cloranfenicol, antibiótico que actúa frente a bacterias pero que no afecta a los hongos. Los parámetros generales que tenemos que tener en cuenta son la fuente de carbono, fuente de nitrógeno, aireación, temperatura, pH e inhibidores. Posteriormente se reaislan en cultivo puro aquellos microorganismos que hemos aislado para su posterior estudio.

Para llevar a cabo un screening primario generalmente se parte de una población mixta (suelo, fermentaciones naturales, etc.) donde existe tanto una gran cantidad como variedad de microorganismos potencialmente útiles que debemos seleccionar. Para ello lo primero que hacemos es utilizar medios selectivos donde crezca el tipo de microorganismo que nos interesa aislar.

Aislamiento de microorganismos del suelo

La muestra de suelo se suspende en agua estéril. Se hacen diluciones 10-1 a 10-10 veces. De cada dilución se siembran por extensión dos placas con 100 µL (0.1 ml) en medios de cultivo (dependiendo del tipo de microorganismos que queramos aislar) y luego se incuban. Se aíslan colonias separadas de distinta morfología y se purifican mediante repiques.

Aislamiento de bacterias por macerado del tejido vegetal

El tejido afectado es macerado en mortero y luego el macerado es estriado en placa.

Aislamiento de bacteria a partir del tejido infectado

Tocando con el ansa en la zona de avance de la infección es posible aislar la bacteria.

Sembrando trozos de tejido vegetal de la zona de avance del patógeno .

Aislamiento a partir de trozos de tejido vegetal

Trozos de tejido afectado de la zona de avance son sembrados en medio de cultivo (ej. Madera)

Métodos de aislamiento

Sembrando trozos de tejido vegetal de la zona de avance del patógeno . Ej: a partir de frutos afectados

Aislamiento a partir de tejido vegetal

En el caso de bacterias es posible macerar un trozo de tejido afectado y luego sembrar

Los trozos de tejido vegetal se someten a una desinfección superficial.

Se busca tomar trozos de la zona de avance para incrementar las chances de aislar al patógeno.

A partir del tejido vegetal enfermo es posible aislar a los patógenos.

LOS MÉTODOS Y TÉCNICAS DE ASILAMIENTO.

Fundamentos, aislamientos directos e indirectos. „ Uso de medios selectivos. „ Uso de cebos.

Aislamiento de flora epifítica, de suelo, rizosfera.

Técnicas de Aislamiento de hongos y bacterias fitopatógenas.

Selección de microorganismos productores de enzimas.

Debido a la dificultad que entraña el manejo de microorganismos, siempre que sea posible, se recurre a utilizar las enzimas producidas por éstos en lugar de las células enteras. A la hora de realizar el screening se debe utilizar en el medio de enriquecimiento como fuente de carbono el sustrato del enzima que buscamos (Amilasas ----> Almidón; Celulasas ----> Celulosa).

Requerimientos

*Disponibilidad de nutrientes. *Consistencia adecuada del medio. *Presencia o ausencia de oxígeno y otros gases. *Condiciones adecuadas de humedad (mantener en frigorífico). *Luz ambiental. *pH adecuado. *Temperatura. *Esterilidad.

Los medios de cultivo, para poder ser utilizados y garantizar que los resultados obtenidos a partir de ellos sean confiables, deben cumplir con los siguientes requisitos:

EL CULTIVO DE LOS MICROORGANISMOS.

El cultivo es el proceso de proliferación de microorganismos al proporcionarles un entorno con condiciones apropiadas. Los microorganismos en proliferación producen réplicas de sí mismos y necesitan los elementos presentes en su composición química. Los nutrientes deben proporcionar estos elementos en una forma que sea accesible desde el punto de vista metabólico. Además, los microorganismos requieren energía metabólica para sintetizar macromoléculas y mantener gradientes químicos esenciales a través de sus membranas. Los factores que deben controlarse durante la proliferación incluyen nutrientes, pH, temperatura, aireación, concentración de sales y fuerza iónica del medio.