TALEN

Ver más

2/3. Как подручными реагентами выделить белки с различными свойствами из одного биологи?

por Valery Zaitsev

2/4. Как разработать наиболее эффективный способ выделения ДНК для домашних условий?

por Valery Zaitsev

Репарация

por Анна Осипова

химические элементы (~100) в живых организмах 9 кл. биология

por Равиля Николаева

TALEN

Регуляция экспрессии генов

Для направленной активации экспрессии генов используются конструкции, содержащие ДНК-связывающий домен TALE и синтетический доменVP64 – TALE-TF.

Попадая в ядро, химерный белок связывается с целевой нуклеотидной последовательностью, домен VP64 привлекает эндогенные активаторы экспрессии генов. При этом значимо увеличивается экспрессия целевого гена, что обычно подтверждают с помощью ПЦР в реальном времени. Возможна также активация не-кодирующих генов, например генов микроРНК .Подавление экспрессии целевого гена может достигаться при использовании химерных белков, содержащих домены KRAB или SRDX .

терапевтическое применение TALE-TF

повышение уровня экспрессии гена FXN, кодирующего белок фратаксин.

Экспансия тринуклеотидных повторов GAA в этом гене приводит к развитию атаксии Фридрейха, при этом структура белка не меняется, однако снижается его экспрессия.Показано, что с помощью TALE-TF можно повыситьэкспрессию гена FXN в фибробластах человека, несмотря на увеличенное число тринуклеотидных повторов

ГЕНОМНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ TALENs

Нецелевые эффекты при использовании системы химерных белков TALENs

1. различия в эффективности связывания RVD и специфических нуклеотидов
2. из-за вырожденности кода связывания нуклеотидов
3. возможна димеризация доменов FokI двух нуклеаз с одинаковыми ДНК-связывающимидоменами
4. размер спейсерной ДНК между сайтами узнавания нуклеаз не фиксирован

4 основных этапа

1. Выбор целевой нуклеотидной последовательности в геноме. 2. Создание нуклеазной конструкции, направленной на выбранную мишень. 3. Доставка этой конструкции в клеточное ядро. 4. Анализ полученных мутаций.

подтема

История

Оказалось, что бактерии секретируют в цитоплазму растительных клеток эффекторные белки (Transcription Activator-Like Effectors, TALE), которые влияют на процессы в растительной клетке и увеличивают ее восприимчивость к патогену. При дальнейшем изучении механизмов действия эффекторных белков было обнаружено, что они способны связываться с ДНК и активировать экспрессию своих генов-мишеней, имитируя факто- ры транскрипции эукариот.

В 2011 году методы высокоточного редактирования геномов, среди которых была и система TALEN, на- званы журналом Nature Мethods методом года

История разработки этой системы связана с изучением бактерий рода Xanthomonas. Эти бактерии являются патогенами таких культурных растений,как рис, перец, томат, они наносят экономически значимый вред сельскому хозяйству, что стало причиной их тщательного изучения.

ПРИМЕНЕНИЕ СИСТЕМЫ TALEN

Нуклеаза делает в сайте-мишени двухцепочечные разрывы, которые репарируются в клетке по одному из двух возможных механизмов

Редактирование генома in vivo

Редактирование генома с помощью TALENs активно используется и у растений

Редактирование геномов растений с помощью системы TALEN к настоящему времени проведено на четырех модельных объектах. Примером растения, которое приобрело новые свойства в результате редактирования генома системой TALEN, служит рис, устойчивый к патогену Xanthomonas oryzaepv.

Редактирование генома in vitro

Могут быть сконструированы нуклеазы TALENs, позволяющие вносить мутации в открытые рамки считывания таких вирусов, как ВИЧ, вирус гепатита B, герпесвирус, которые могут находиться в организме в латентном состоянии и не поддаваться терапии, направленной на реплицирующиеся вирусы

Так с помощью TALEN s можно модифици- ровать ген C-C рецептора хемокина 5 T-лимфоцитов, мутации в котором делают человека невосприимчи- вым к ВИЧ

карочиря ище с муковисцидозом

Гомологичная рекомбинация, при которой непо- врежденный гомолог служит матрицей для восста- новления исходной структуры ДНК

это событие происходит в клетке довольно редко, но использование TALENs позволяет повысить вероятность прохождения гомологичной рекомбинации на несколько порядков.

Строение TALE

ДНК-связывающий домен

ДНК-связывающий домен состоит из мономеров,каждый из которых связывается с одним нуклеотидом в целевой нуклеотидной последовательности.Мономеры представляют собой тандемные повторы из 34 аминокислотных остатков, из которых два, расположенные в позициях 12 и 13, высоко вариабельные (Repeat Variable Diresidue, RVD), и именно они отвечают за узнавание определенного нуклеотида.

RVD

В большинстве работ используют мономеры, содержащие RVDAsn и Ile (NI), Asn и Gly (NG), два Asn (NN), His и Asp(HD)

После расшифровки кода узнавания ДНК белками TALE, который привлек внимание ученых всего мира благодаря своей простоте (один мономер – один нуклеотид), были проведены первые работы по созданию химерных нуклеаз TALENs.

С этой целью последовательность, кодирующая ДНК-связывающийдомен TALE, встроили в плазмидный вектор, использованный ранее при создании ZFN

Белки TALE состоят из центрального домена,ответственного за связывание ДНК, сигнала ядер-ной локализации и домена, активирующего транскрипцию целевого гена

Впервые способностьэтих белков связываться с ДНК была описана в 2007 году, а всего через год двумя группами ученых был расшифрован код узнавания целевой последовательности ДНК белками TALE

Введение

Все началось в 1972 году в лаборатории Пола Берга, когда ученые объединили геном кишечной палочки с генами бактериофага и вируса SV40.

ZFN (Zinc-finger Nuclease)

В 1996 году было впервые показано, что белковый домен типа «цинковые пальцы», соединенный с FokI-эндонуклеазным доменом, действуеткак сайт-специфическая нуклеаза, разрезая ДНК in vitro в строго определенных участках

Transcription Activator-Like Effector Nucleases
(эффекторные нуклеазы, подобные активаторамтранскрипции)


Такая системы, активно применяемая для различных манипуляций с геномами, позволяет решать сложные задачи,включая получение мутантных и трансгенных растений и животных, создание и исследование моделей заболеваний на основе культивируемых плюрипотентных клеток человека.

Кроме того, химерные белки на основе ДНК-связывающих доменов TALE используют в экспериментах по регуляции транскрипции генов,для изучения эпигеномов и поведения хромосомных локусов в клеточном цикле.