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METODOS DE SIEMBRA

METODOS DE AISLAMIENTO Y PURIFICACION

PURIFICACION

De las colonias obtenidas se toma una colonia bien aislada en forma estéril y se estría en una nueva placa con medio de cultivo adecuado. Este procedimiento se repite al menos dos veces para considerar que se ha obtenido un cultivo puro.

ESTRIAS EN PLACA POR EXTENSION

La técnica se realiza de la misma manera que para realizar el recuento. La finalidad es diferente ya que aquí sólo queremos observar qué microorganismos están presentes en la muestra sin importar cuantos son.

ESTRIAS EN PENTAGONO

Teniendo las mismas precauciones y la preparación previa del medio como se describen anteriormente, al realizar la siembra las estrías se disponen en forma de pentágono

ESTRIAS EN PARALELO

Se siembra con ansa previamente esterilizada a la llama (flameada), que se humedece con la suspensión microbiana o la muestra y abriendo la caja apenas lo necesario, cerca del mechero, se hacen seis trazos paralelos en la superficie del medio. Los trazos deben quedar separados entre sí, luego de cada uno, se levanta el ansa para hacer el siguiente. El ansa queda cada vez más empobrecida en microorganismos y luego de la incubación se formarán colonias separadas por lo menos en el último trazo. Las cajas sembradas se incuban con la tapa hacia abajo, para evitar la desecación del medio

Agregar a la caja de Petri el medio adecuado (plaquear), esterilizado y enfriado a 45°- 50°C. Se saca el tapón de algodón, flamea la boca de tubo y vuelca rápidamente en una caja de Petri estéril apenas abierta, dando un leve movimiento circular para que se distribuya por toda la superficie y se deja solidificar.

MANTENIMIENTO

LIOFILIZACION

Este método permite aumentar notablemente el tiempo de mantenimiento del microorganismo, en algunos casos más de 20 años. Se realiza en un equipo, liofilizador, como se muestra en la figura. Consiste en suspender el microorganismo en leche estéril, suero o alguna otra sustancia igualmente protectora en una ampolla de vidrio o tubo tapa a rosca, congelar rápidamente y deshidratarlo rápidamente mediante vacío. Finalmente el cultivo es sellado y almacenado.

CONGELACION

El microorganismo suspendido en solución crio protectora es adsorbido en perlas y conservado a – 20 o – 180 ºC; como es el caso de los viales Cryobank

PUNCION

Al igual que en PICO DE FLAUTA, pero el medio no se encuentra inclinado. La siembra se realiza con el ansa recta, la que, luego de introducir en la suspensión microbiana, se descarga por punción en el medio

PICO DE FLAUTA

El agar inclinado provee una superficie conveniente para el mantenimiento de un cultivo puro, especialmente para microorganismos aerobios. Para ello debe fundirse el medio de cultivo, fraccionar en tubos, esterilizar y dejar enfriar en posición inclinada. Luego transferir el material con tres trazos paralelos y otro en zig-zag uniendo las tres líneas desde abajo hacia arriba, llevar a incubar un tiempo y temperatura adecuado y una vez obtenido el cultivo guardar en heladera. Este método permite conservar los microorganismos viables por un período aproximado de meses a 1 año dependiendo de las mismas

METODOS DE DETECCION

CUANTITATIVOS

FILTRACION POR MEMBRANA

Esta técnica se utiliza para el control microbiológico de aguas, vinos, jugos, mostos concentrados entre otros. Permite concentrar los microorganismos presentes analizando un elevado volumen de muestra. Los microorganismos quedan retenidos sobre la superficie de la membrana filtrante. Luego se coloca la membrana sobre un medio de cultivo que difunde por capilaridad y proporciona los nutrientes necesarios para que los microorganismos desarrollen formando colonias visibles.

POUR ´PLATE

En el método de siembra por vertido en placa o Pour plate se procede a depositar 1 ml de cada dilución en placas estériles, vacías y por duplicado. Posteriormente se agrega a cada placa 15 a 20 ml de medio de cultivo a emplear, previamente fundido y termostatizado a 45 ºC en baño de maría. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimiento circular. Así, la muestra se mezcla con el medio de agar. Luego se incuba la muestra en forma invertida y , después del tiempo de incubación en estufa se retiran las placas y se cuentan las colonias desarrollas por placa

SIEMBRA POR EXTENSION EN SUPERFICIE

SIEMBRA

Se siembra un determinado volumen (0,1 o 1 ml) de muestra o suspensión sobre la superficie de un medio de cultivo sólido y estéril y se esparce por toda la caja por medio de una varilla de vidrio en L o espátula de Drigalsky. SE deja que la muestra dispersa se absorba en la superficie del agar, se invierte la placa y se incuba en estufa a la temperatura apropiada. Luego del tiempo de incubación en estufa se retiran las placas y se cuentan las colonias desarrollas por placa. Se distribuye un volumen conocido de muestra, por lo que esta técnica sirve para conocer el número de microorganismos viables.

PREPARACION DEL MEDIO

Agregar a la caja de Petri el medio adecuado (plaquear), esterilizado y enfriado a 45°- 50°C. Se saca el tapón de algodón, flamea la boca de tubo y vuelca rápidamente en una caja de Petri estéril apenas abierta, dando un leve movimiento circular para que se distribuya por toda la superficie y se deja solidificar.

NUMERO MAS PROBABLE

Se utilizan series de 3 o 5 tubos y por lo menos 3 diluciones consecutivas en medio liquido. En este caso la cantidad de microrganismos se expresa como un NMP (Numero mas probable) por g o ml.

CUALITATIVOS

ENRIQUECIMIENTO

Se realiza cuando es necesario aumentar el numero de microorganismos que se desean aislar e inhibir a la microbiota acompañante, con el objetivo de elevar la posibilidad de aislarlo.

PRE-ENRIQUECIMIENTO

Su finalidad es incrementar el numero de un determinado microorganismo. Se realiza para revitalizar los microorganismos lesionados, incrementar su vitalidad y adquirir condiciones fisiológicas adecuadas para su correcto desarrollo.