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Técnicas Diagnósticas

Eletrofoese

Como os fragmentos de DNA movem-se através do gel?

Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA e depois colocado sob luz UV, os fragmentos de DNA brilham, o que nos permite visualizar o DNA presente em diferentes locais ao longo da extensão do gel.

Uma "linha" bem definida de DNA em um gel é chamada de banda.

As moléculas de DNA têm carga negativa devido aos grupos fosfato em seus esqueletos de açúcar-fosfato, assim elas começam a se mover através da matriz de gel, para o polo positivo. Quando a energia é ligada e a corrente passa através do gel, diz-se que o gel estácorrendo.

Todas as moléculas de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa. Por essa razão, a eletroforese em gel de fragmentos de DNA faz a separação baseada apenas no tamanho.Podemos também determinar o tamanho absoluto de um pedaço de DNA examinando-o ao lado de um DNA "padrão", composto de fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos.

Aplicações

O DNA pode ser visualizado por eletroforese em gel, enviado para sequenciamento, ou digerido por enzimas de restrição e clonado em um plasmídeo.

Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA, os fragmentos de DNA podem ser vistos comobandas, cada uma representando um grupo de fragmentos de DNA de mesmo tamanho.

Os fragmentos DNA estão carregados negativamente, então movem-se na direção do eletrodo positivo. Já que todos os fragmentos de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa, os fragmentos menores atravessam o gel mais rapidamente do que os maiores.

As amostras de DNA são carregadas nos poços (cavidades) localizados numa das extremidades de um gel, e uma corrente elétrica é aplicada para fazê-las avançar pelo gel.

é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho.

PCR

Etapas

Extensão(72 °C): Eleva a temperatura da reação para que aTaqpolimeraseestenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA.

Anelamento(55 C°): Resfria a reação para que os primerspossam se ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples.

Desnaturação(96 °C): Aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar, as fitas de DNA. Isso proporciona um molde de fita simples para a próxima etapa.

Primers de PCR

Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por volta de20aminoácidos de comprimento. Dois primerssão usados para cada reação de PCR, e eles são projetados de modo que englobem a região de interesse (região que deve ser copiada). Isto é, são dadas sequências que os farão se ligar a fitas opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região a ser copiada. Os primersse ligam ao molde por pareamento de bases complementares.

Taq polimerase

Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer uma enzima DNA polimeraseque faça novas fitas de DNA usando as existentes como moldes. A DNA polimerase tipicamente usada na PCR é chamada de Taq polimerase, em homenagem à bactéria resistente ao calor da qual ela foi isolada (Thermusaquaticus).

tem muitas aplicações práticas e em pesquisa. Ela é rotineiramente usada em clonagens de DNA, diagnósticos médicos e análises forenses de DNA.

a reação é repetida ciclicamente através de uma série de alterações de temperatura, o que possibilita a produção de muitas cópias da região de interesse.

depende de uma DNA polimerasetermoestável, aTaqpolimerase, e requerprimersde DNA projetados especificamente para a região de interesse do DNA .

é uma técnica para fazer muitas cópias de uma região específica do DNA,in vitro(em um tubo de ensaio, ao invés de um organismo).