2/4. Как разработать наиболее эффективный способ выделения ДНК для домашних условий?

Honelako gehiago

Результат

by Галина Николаевна Петрухно

Стандарты как совокупность требований

by Марьям Измайлова

География

by Коля Соколов

Артур Конан Дойл

by Юля Салашник

клетка

разрушение клеток

удаление дебриса

выделение ДНК из гомогентата

очистка ДНК от примесей

идеально: чистая неповрежденная ДНК

самая общая и типичная схема выделения ДНК

есть множество вариантов

какой метод легче всего адаптировать к домашним условиям?

в чистом виде ни один - но можно скомбинировать

Для бактерий хорошим прототипом является метод щелочного лизиса с детергентами

что нужно?

осадитель

щелочь

при рН > 9 в среде быстро разрушаются примеси РНК, кроме того, щелочные условия улучшают эффективность разрушения клеточной стенки

соли

создают нужные ионную силу и осмотическое давление, модифицируют растворимость ДНК (соли магния, например) или балластных веществ

забуферивающие компоненты

поддерживают величину рН примерно постоянной в ходе выделения - например, сочетание нужных пропорций уксусной кислоты (столового уксуса) и NaOH (например, из средства для очистки канализационных труб) или сочетание натрия карбоната (кальцинированная сода) и бикарбоната (питьевая или чайная сода)

детергент (ПАВ)

Нарушает стабильность клеточной мембраны, способствуя разрушению клетки

Статьи для чтения

Антонова с соавт., 2009

Антонова О.С., Корнева Н.А., Белов Ю.В., Курочкин В.Е. Эффективные методы выделения нуклеиновых кислот для проведения анализов в молекулярной биологии. Научное приборостроение. 2010: 20(1): 3-9

Лабораторная работа 2/4

оформление результатов

Выполняется внеаудиторно. Загружается дистанционно для оценки преподавателем с использованием выбранного формата интерактивного общения (LMS, облачное файлохранилище, социальные сети, онлайн-сервисы организации совместной работы и т.д.).

2/4 - описательное с количественными результатами

В свободной форме, отражающей:

цель эксперимента,
протокол выполнения работы,
обоснование использования тех или иных заменителей лабораторных реагентов;
расчеты используемых концентраций общедоступных веществ и материалов;
пошаговые иллюстрации выполнения протокола в виде фото- или видеофайлов;
результаты определения содержания ДНК в финальном препарате и расчет достигнутого выхода ДНК из бактериальной массы;
сравнить результаты, полученные по собственному протоколу, с результатами выделения фабричным набором реактивов)
общий вывод с указанием, достигнута ли цель эксперимента.

лабораторные протоколы

2/4. Выделение ДНК из бактериальных клеток

Протокол выполнения опыта

Важно! студенты сами разрабатывают протокол и приносят общедоступные материалы для его осуществления на занятие. Параллельно с собственным протоколом студенты всех подгрупп проводят выделение ДНК одним из стандартных методов с использованием готовых наборов реагентов (например, Biosilica GBD-50 (протокол: http://biosilica.ru/wp-content/uploads/2015/12/GBD-50.pdf), или любой другой по усмотрению преподавателя).

Обязательные компоненты протокола

Осаждение клеток из культуры с использованием одной из самодельных центрифуг, протестированных в работе 2/2.
Разрушение клеток в присутствии детергента.
Использование щелочной среды для разрушения РНК.
Использование протеиназ для разрушения белков.
Осаждение ДНК с помощью органического растворителя.
Перерастворение осажденной ДНК в буферном растворе для хранения.

После получения финального препарата ДНК в буферном растворе проводится определение содержания ДНК подходящим чувствительным методом (например, фотометрически при длине волны 260 нм или флюориметрически на приборе Qubit 4 (Thermo Fischer) или MaxLife (МВМ-Диагностик, Россия).

Затем финальный препарат замораживается до использования на занятии 3 (лабораторная работа 3/1).

организация работы

Подготовительная часть (преподаватель + лаборант): подготовка необходимых материалов и оборудования.

Подготовительная часть (лаборант): выращивание культуры бактерий Lactobacillus plantarum, Propionibacterium freudenreichii, Streptococcus thermophilus и(или) Lactococcus lactis subsp. diacetilactis. Данные культуры выбраны, поскольку они легко доступны в качестве моновидовых заквасок и легко растут на молоке или молочных средах. Могут быть заменены на любые другие непатогенные бактерии.

Основная часть (студенты на занятии): работа ведется в подгруппах, сформированных в конце занятия 1. Протокол выполнения разрабатывается студентами в качества внеаудиторной самостоятельной работы между занятиями 1 и 2. По усмотрению преподавателя каждым методом может выделяться ДНК из одного или нескольких бактериальных культур.

Важно! Поскольку студенты работают с разными условиями экспериментов преподавателю следует обеспечить студентам возможность ознакомиться с результатами друг друга. Делать это в ходе выполнения эксперимента или во время заключительного мини-коллоквиума занятия - выбор преподавателя.

Также важно! Образцы, полученные в ходе работы, используются далее в ходе лабораторной работы 3/1.

результаты обучения

вопросы для обсуждения

Какие компоненты среды для выделения являются необходимыми для выделения ДНК, а какие лишь могут повысить эффективность или удобство выделения?
Какие группы детергентов (ПАВ) существуют и какие особенности их свойств могут повлиять на эффективность выделения ДНК?
Что можно использовать из общедоступных веществ и материалов для селективного разрушения белков при сохранении структуры ДНК?
Какие факторы влияют на эффективность выделения ДНК методами с использованием общедоступных реагентов?

развиваемые навыки

адаптировать существующие лабораторные протоколы к использованием других реагентов и материалов
разрабатывать новые лабораторные протоколы
оценивать эффективность выделения целевого продукта из биологического материала

Выделение ДНК из клеток

что нужно сделать?

избавиться от:

многие вещества (как высоко-, так и низкомолекулярные) могут либо разрушать ДНК (нуклеазы), либо связывать её, либо мешать её определению (например, РНК и низкомолекулярные нуклеотиды при фотометрическом анализе или ингибиторы амплификации при ПЦР-анализе)

других балластных веществ

удалить

РНК

разрушить и удалить продукты деградации

белков

разрушить или удалить

субклеточных частиц

Различные органеллы, куски мембран, клеточный дебрис из гомогената после разрушения (лизиса) клеток - обычно используют центрифугирование

извлечь ДНК из клетки

При выделении из образцов окружающей среды или из культуральной среды

2019, Валерий Зайцев. Это произведение доступно по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial («Атрибуция — Некоммерческое использование») 4.0 Всемирная