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CUANTIFICACIÓN DEL ADN
- Existen distintos métodos para cuantificar la concentración de ADN. - Su elección varía según el nivel de pureza de la muestra (es decir, sin cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol, agarosa u otros ácidos nucleicos). - Ningún método es realmente efectivo, todos proporcionan datos estimados. - Es de gran importancia para el análisis de PCR, y la patología tumoral pues contribuyen al diagnóstico y valoración pronóstica de los pacientes.
INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA
Existen otros métodos tales como
FLUOROMETRÍA
- Método de análisis utilizado para medir la intensidad de la radiación que emite un material fluorescente al ser excitado con luz ultravioleta. - Se basa en la medición de señales de luz que son convertidas mediante amplificadores a señales de voltaje. - Se emite luz ultravioleta de aproximadamente 365 nm que incide sobre la muestra y la excita. - La fluorometría es más sensible al medir la concentración de ADN, permitiendo la detección de nanogramos de ADN. - Esta técnica se ha utilizado para estudiar las interacciones entre lípidos y proteínas. - Existen muchos tintes fluorescentes como PicoGreen® y QuantiFluor ™ que se unen específicamente al ADN de doble hebra y permiten medir su concentración.
DENSITOMETRÍA
- Permite la realización de un análisis cualitativo
-El gel es digitalizado y la imagen es usada para dicha cuantificación
-Se requiere la utilización de un scanner (densitómetro), y la implementación de un software para la obtención de datos mediante la comparación de intensidades y áreas de las bandas de ADN
PROCESO
-Se hace una tinción previa en el gel de agarosa (bromuro de etidio), vertido con el gel del densitómetro, se da el proceso del corrido electroforético, buffer con bromuro de etidio a una concentración de 0,5 µg por ml para un tiempo prescrito de 30 a 60 minutos dependiendo de la
espesor del gel.
- Cabe resaltar que la concentración y el grosor del gel afectan ya que ambos retrasan la velocidad de difusión, la aplicación de los geles debe ser aplicada de manera adecuada para la correcta visualización de la imagen , ya que puede ser saturada y crear pixeles.
FUNDAMENTO TEORICO
- Esta técnica está basada en el espectro electromagnético.
- Se fundamenta en que "cualquier solución que contenga moléculas suspendidas permite el paso de un haz de luz a través de ella en proporción inversa a la cantidad de moléculas que contiene". - El proceso inicia cuando la luz UV, emitida por una lámpara, pasa por un condensador y se dirige hacia la muestra, que se encuentra en una celda de cuarzo. - La luz será absorbida de manera proporcional de acuerdo a la concentración de la muestra. - Un detector mide la luz que no es absorbida por la muestra, esta se resta a la luz inicial emitida y genera así una lectura en unidades de absorbancia entre 0.001 a 1.000.
- Mientras más luz absorba la muestra (absorbancia) mayor será la concentración de ácidos nucleicos.
- La densidad óptica (OD) es la unidad de absorbancia y tiene valores particulares para cada molécula específica en una determinada longitud de onda por unidad de distancia. En el caso de los ácidos nucleicos, una OD de 1 a 260 nm equivale a 50 μg/ml de ADNds, 37 μg/ml de ADNss
CARACTERISTICAS
- Es un proceso rápido, simple y evita la destrucción de la muestra
- Es el método más común a la hora de medir la cantidad de ADN y ARN en soluciones puras concentradas.
- Es comparativamente insensible
- Requiere de concentraciones de ácidos nucleicos de al menos 1μg/ml para obtener un estimado confiable de A260.
- No se puede distinguir fácilmente entre ADN y ARN, y no puede usarse en preparaciones de ácidos nucleicos que no hayan sido purificadas.
ANTECEDENTES
- Los nucleótidos de ADN y ARN presentan la absorción máxima a una longitud de onda de 260 nm (luz ultravioleta, UV). - La estructura química del ADN confiere su capacidad de absorbancia a determinada longitud de onda; p. ej. los anillos heterocíclicos que hacen parte de las bases nitrogenadas. - Se reconoce que los grupos potencialmente reactivos se encuentran dentro de la hélice central, atados por enlaces de hidrógeno; mientras pares de bases están protegidos por una notable envoltura de fosfatos y azúcares y están reforzados internamente por fuertes fuerzas de apilamiento.
