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Biología molecular: Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud (1a. ed.--.). México D.F.: McGraw Hill.
Así la localización de la secuencia de nucleótidos que se va multiplicar exponencialmente es específica.
Hibridación In Situ
Hibridación In Situ cromosómica
Se realiza sobre preparaciones de cromosomas metafásicos o prometafásicos, tratadas con reactivos fijadores para preservar las características morfológicas del cromosoma.
Se trata la muestra con enzimas proteolíticas y se desnaturaliza el DNA mediante calor, álcali o formamida para permitir su hibridación con la sonda
Elevado potencial diagnóstico en cromosomopatías, genes tumorales, virología, trasplantes.
Es una técnica donde se usa una muestra biológica que consiste en cortes de tejido, células o cromosomas de un individuo se fija a un portaobjetos de vidrio y luego se expone a una “sonda”, que es una pequeña secuencia de ADN de una sola hebra marcado con un tinte químico o fluorescente.
Las sondas están marcadas con colorantes fluorescentes
Se realiza sobre cortes de tejido, células intactas, núcleos aislados, etc.
Es usado para detectar virus patógenos
Para diagnosticar células cancerosas como consecuencia de cambios genéticos
Para estudiar cambios en la expresión génica, detectando secuencias en el RNA celular
La detección se realiza por autorradiografía y examen de la película fotográfica bajo el microscopio, o por microscopia de fluorescencia, si se empleó este marcaje para la sonda.
Hibridación en soporte sólido
Permite procesar varias muestras de forma simultánea y facilita el control de la hibridación.
Son válidas para el análisis de ácidos nucleicos y el diagnóstico de enfermedades moleculares con base genética.
Es el método empleado para identificar, de entre varias colonias bacterianas en placas de cultivo con agar, las que contienen un gen o fragmento de DNA de interés bajo la forma de plásmido recombinante
Se divide en
Southern blot
Se utiliza para detectar la presencia de moléculas específicas de ARN en una muestra específica.
Proporciona información sobre moléculas que hibridan. Por ejemplo, su tamaño molecular.
Se utiliza para examinar patrones de expresión génica en tejidos embrionarios y en adultos.
Se utiliza también para caracterizar y cuantificar la actividad transcripcional de un gen determinado en distintas células, tejidos u organismos.
Se usan generalmente para caracterizar la identidad de genes específicos, para localizar regiones codificantes o regiones reguladoras flanqueantes en secuencias clonadas. Por ende, sirve para investigar la organización molecular de las secuencias genómicas.
Para uniones ADN- ARN
Se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda.
Se utiliza para obtener información sobre el tamaño de ARN
Además para conocer qué genes están activos formando ARNm, en qué tejidos o tipos celulares.
En este el ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, en condiciones que mantenga las cadenas de ARN, desnaturalizado.
Northern blot
Para uniones ADN-ADN
Aplicaciones
Se lo utiliza para analizar fragmentos de DNA generados por digestión con enzimas de restricción.
Se prepara ADN con enzima de restricción y los fragmentos se separan por tamaños, mediante electroforesis en un gel.
Luego los fragmentos son desnaturalizados y se separan las 2 hebras componentes de ADN en sus cadenas sencillas.
Posteriormente, el ADN inserto en el gel, es transferido a un filtro de nitrocelulosa, y queda representado una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel.
Finalmente el filtro se incuba, con la sonda; durante la incubación, la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria
Dot - blot y Slot - blot
Es el método más simple y común, gracias a la posibilidad de emplearlo con muestras de ácido nucleico sin purificar.
La muestra se aplica, bien gota a gota (dot-blot) o en manchas alargadas (slot.blot)
sobre un "filtro" de nailon o nitrocelulosa, cuyas propiedades de adsorción fijan las moléculas de ácido nucleico y proteína.
Hibridación en fase líquida
Esta utiliza una muestra de DNA o RNA, en disolución, además se realiza la hibridación con la sonda
