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Medicamentos BIológicos

Linhagem celular

Banco de células que vendem no mundo - ainda não são recombinantes

Obtenção de fragmentos de interesse

PCR

Uso de transcriptase reversa para produção do cDNA a partir do DNA

Partir do RNAm pois o DNA possui íntrons e éxons - retirados no processamento de RNA

Primers específicos para a sequência de interesse

Critérios para a escolha da célula

Custo de produção

Velocidade de replicação da célula

Padrão de modificação pós taducional (em especial glicosilação)

Faz-se as modificações gnéticas pretendidas para obtenção da proteína final desejada

LINHAGEM RECOMBINANTE

Inserção do gene de interesse em um vetor para carrear o fragmento até o genoma da célula hospedeira

Utilizando enzimas de restrição - 2 gerar extremidade coesivas (utilizar as mesmas enzimas no gene e no plasmídeo)

Conceito principal

Biofármacos - são medicamentos produzidos a partir da expressão de uma determinada proteína de interesse em uma célula,seja ela de bactéria ou de mamíferos

Vantagens

Permite o desenvolvimento de moléculas mais eficientes - maior tempo de meia vida, maior efetividade

Produção em larga escala e com alta qualidade final (pureza)

Sequência de resíduos de aminoácidos idêntica a da proteína humana - maior compatibilidade com o organismo humano

Riscos associados

Também relacionados com a alta complexidade das moléculas, tornando o processo custoso e caro - Heterogenicidade nas macromoléculas

Principalmente relacionado à imonogenicidade desses medicamentos e risco de contaminação, principalmente por vírus

Biotecnologia moderna permitiu o avanço de técnicas para essa produção

Exemplos:

Tratuzumabe - anticorpo monoclonal usado no tratamento do cancer. Bloqueia a sinalização intracelular inibindo a ploriferação de células tumorais

Natalizumabe é indicado como terapia única no tratamento da Esclerose Múltipla recorrente-remitente, para prevenir surtos e retardar a progressão da doença

Adalimumabe: destinado ao tratamento da artrite reumatoide grave, ativa e progressiva em pacientes.Anticorpo monoclonal humano Anti-TNF alfa

Hibridomas

Biotecnologia moderna

Técnica de produção

Utilização de:

Célula mieloma (replicação ilimitada)

Células esplênicas com anticorpos desejado (replicação limitada)

fusão das células

Formam o hibridoma com capacidade de multiplicação indefinida e pode produzir o Ac monoclonal que se deseja

Cultivo emmeio adequado

Propagação

Processo ocorre em fermentadores ou em céluas animais (in vivo)

Permitem o crescimento apenas dos hibridomas

Seleção da célula que produz o anticorpo de interesse

Anticorpos monoclonais a partir da maquinaria de uma célula

Isolamento de uma única célula que produzirá um único tipo de anticorpo

Interagem com o mesmo epítopo

Possuem a mesma região de complementariedade ( região variável)

Derivados de uma mesma linhagem

Transformação de transfecção

Gerar poros temporários na parede celular e membrana plasmática, permitindo a passagem do DNA exógeno

Choque térmico

Aumento repentino de temperatura criando diferenças de pressão entre o exterior e o interior da célula induzindo a formação de poros na membrana

Eletroporação

Campo eléctrico é aplicado nas células de modo a aumentar a permeabilidade da membrana celular

Vetores (estruturas com elementos parareplicação do material genético) Plasmídeos (DNA circulares capazes de se autoreplicar)

vetores de expresão (expressão de proteínas)

Elementos necessários: elementos dos vetores de clonagem mais promotor ( interação com DNA polimerase), sitio de ligação do ribossomo (região vai ser traduzida), sequencia de termino de transcrição (RNA polimerase para transcrição)

vetores de clonagem (clonagem do material genético)

Elementos necessários: Origem de replicação (reconhecida pela DNA polimerase), marcas de seleção (identificação célula com o DNA exógeno), sítio múltiplo de clonagem (enzimas de restrição)

Técnica do DNA recombinante

Multiplicação do vetor

Inserção do DNA de interesse

Enzimas de restrição e DNA ligase

Molécula de DNA recombinante

Clivagem do plasmídio do vetor

Obtenção da sequência nucleotídica que codifica a proteína de interesse

Síntese química do gene

Reação em cadeia da polimerase

Banco de Células Mestre

Característica das linhagens

Nenhuma alteração das características fenotípicas e genotípicas

Linhagem de expressão estável

Clones mais eficiente

Congelamento

Crioprotetores

<100°C

Qualidade e caracterização

Pureza

Estabilidade

Identidade

Armazenamento de clone mais produtivo

Banco de células de trabalho

Ex: antes de realizar uma cromatografia de troca iônica (comumente a primeira) deve-se trocar o tampão antes de aplicar na coluna cromatográfica - precisa do pH adequado

Recuperação e Purificação

Etapa downstream do processo

Remoção de impurezas e contaminantes

Células de mamíferos - possuem sistemas de excreção da proteína de interesse para o meio de cultivo

Etapa 1- Clarificação:separação das células do meiode cultivo (por filtração ou centrifugação)

Etapa final - Polimento

Remoção de contaminantes que são mais parecidos com a proteína de interesse

Uso de cromatografia de exclusão molecular ou troca iônica

Diafiltração final ocorre nessa etapa

Etapa intercalada- Diafiltração (caso seja necessário) - processo de troca do solvente utilizado

Diafiltraçãp final - colocar a proteína purificada em um tampão com pH adequado para o envase e administração

Uso de poros muito pequenos que retem a nossa proteína de interesse - ocorre também o aumento da concentração da proteína

Etapa 2- Recuperação / isolamento primário

Filtração esterilizante - reduzir os riscos de contaminação viral

nanofitração associado a métodos químicos de remoção (detergente,pH ácido)

Cromatografia Líquida - separação de moléculas entre uma fase estacionária (sólida) e uma fase móvel (liquida) dentro de uma coluna cromatográfica

Uso de diferentes cromatografias

Uso de troca iônica - eluição através de altas concentrações salinas

Depois coluna de interação hidrofóbica - meio já possui alta concentração salina

Interação - entre a proteína e resíduos hidrofóbicos presentes na matriz

Solução com alto teor de sal

ions nomeio removeram a camada de solvatação que a água forma ao redor da proteína - resíduos hidrofóbicos estão internos

Exposisão desses resíduos proporciona interação com a matriz

gradiente de concentração salina decrescente - elui primeiro proteínas com interação fraca, depois moderada e por ultimo elevada

Troca iônica - Resíduos de aminoácidos possuem cargas

Eluição utiliza solução com alta concentração de sal - pode afetar a estabilidade da proteína

Carga total da proteína depende do pH do meio (carga líquida) asociado ao ponto isoelétrico

pH menor que PI - carga líquida positiva

pH maior que PI - carga líquida negativa

Aplicação de campo elétrico para ocorrera migração diferencial das proteínas

Afinidade - Interação altamente específica entre a proteína e um ligante que estará presente na fase móvel

Técnica muito seletiva

Ex: resina absorvida com proteína A - se liga a porção não específica dos anticorpos (região Fc)

Retirada do Ac por meio:

3- adição de uma cauda polo A - afinidade com o níquel

2- fase móvel que interaja mais com a proteína A

1- alteração do pH da fase móvel - alterada levemente a forma da proteína

Exclusão molecular - separação por meio do peso molecular, forma e tamanho da molécula- maiores eluem primeiro e menores ficam mais tempo retidas na FE

Células de bactérias - biofármaco fica dentro do citoplasma

Etapa 1- Rompimento da célula para liberação da proteína no meio

Expressões

Estável

Realização da seleção de clones e possibilidade de integração sítio específica do gene

ELISA

Clonagem por diluição limite

Simples porém demorada - análise de centenas de clones

Fatores que influenciam: números de cópias dos genes que serão inseridas,posição da integração, força do promotor eficácia da transfecção

Produção duradoura, mais utilizada na industria

Integração, através da recombinação não homologa, do DNA exógeno em alguma região do cromossomo da célula hospedeira

Transiente

Fatores que influenciam: força do promotor e eficiência da transfecção

Rápida, caracterização da proteína e avaliação do plasmídeo

Sintese proteica recombinante por curto período de tempo. cDNA se replica como unidade extra cromossomal.

Biofármacos expressos em células (escolha depende do produto)

Bactérias

Ex: E. coli

Não realizam modificações pós traducionais, necessidade da realização da lise celular para obtenção do produto o que aumenta o custo com a purificação

Meios simples, cultivo barato, multiplicação rápida, estrutura celular mais simples

Mamíferos

Modificações pós traducionais

Principalmente glicosilação - adição de uma cadeia de carboidratos a um resíduo de aminoácido na proteína final

Padrão de glicosilação é espécie específica, podendo ter pequenas alterações mesmo em cels diferentes de uma mesma linhagem

Pode ser do tipo N-glicosilação ou O-glicosilação

São camadas de glicoformas - 2 ou mais moléculas de proteína produzidas pela mesma célula com micro diferenças no padrão

Controle de qualidade: faixas permitidas de cada glicoforma

ex: células CHO

Meios complexos, estrutura celular mais complexa, multiplicação mais lenta, cultivo caro

Proteínas com modificações pós traducionas (glicoproteínas) 60/70%, biofármaco mais similar a molécula do organismo melhorando a imunogenicidade, geralmente ocorre asecreção da proteína facilitando a purificação (não precisa fazer a lise da célula)