5/2. Можно ли покрасить бактерии по Граму реактивами только из магазина и аптеки?

Кислоты

by Татьяна Сарина

1/3. Что нужно для микроскопии растительных клеток с минимальными затратами?

by Valery Zaitsev

ЭТАН(C2H6)

by Сергей Платонов

МАСТЕР -УНИВЕРСАЛ

by Cветлова Анастасия Анатольевна

двухцветная окраска

Грам-положительные микроорганизмы окрашиваются обычно в темно-синий или фиолетовый цвет (комплекс первичного красителя с йодом), а при использовании бриллиантового зеленого - в ярко-зеленый, окраска грам-отрицательных микроорганизмов зависит от цвета вторичного (дополнительного) красителя: например, розовая или розово-фиолетовая при окрашивании фуксином, красная при окрашивании сафранином, нейтральным красным или конго красным

Использована фотография, выполненная Y tambe, CC-BY-SA

последовательность окрашивания

приготовление мазка

Исследуемый материал (жидкость или суспензия) равномерно распределяют на определенном участке предметного стекла и высушивают. После полного высыхания мазка его фиксируют (стадия 2)

фиксация мазка

способы фиксации

химическая

При химической фиксации высушенный мазок погружают (обычно на 10 мин) в один из органических растворителей:

метанол
этанол
ацетон
смесь Никифорова (равные объемы этанола и диэтилового эфира) - неприменима в самодеятельных условиях
жидкость Карнуа (60% этанола, 30 % хлороформа, 10 % ледяной уксусной кислоты) - неприменима в самодеятельных условиях

термическая

наиболее распространенный и более быстрый способ фиксации, по сравнению с химической - для термической фиксации высушенный мазок два-три раза проводится над пламенем горелки или спиртовки

первичное окрашивание

Используемый на этом этапе краситель в отечественной литературе чаще всего называется основны́м, при этом по химической природе он должен быть оснóвным - чтобы избежать двусмысленности из-за игры слов, я использую термин «первичный краситель». Аналогичный термин широко применяется в англоязычной литературе (primary dye)

обработка йодом

Обычно фиксируют раствором Люголя (в микробиологии соотношение йода, йодида калия и воды 1:2:100) - не путайте его с аптечным раствором Люголя (те же компоненты в соотношении 1:2:17). Также может использоваться раствор Грама (соотношение йода, йодида калия и воды 1:2:300)

обесцвечивание первичной окраски

проводят короткой обработкой органическими растворителями - этанолом, метанолом, ацетоном

для улучшения результатов (во избежание переобесцвечивания) можно использовать йодный спирт (0,1% йода и 0,5% йодида калия в этаноле)

вторичное окрашивание

Обычно используются анионные красители

окраска по Граму - многостадийный процесс

Когда протокол окрашивания клеток содержит несколько этапов формирования окраски, а получающаяся окраска будет минимум двухцветной - такие окраски называют сложными

Статьи для чтения

Silhavy e.a., 2010

Silhavy T.J., Kahne D., Walker S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2010; 2(5): a000414. doi: 10.1101/cshperspect.a000414

Alturkistani e.a., 2015

Alturkistani H.A., Tashkandi F.M., Mohammedsaleh Z.M. Histological Stains: A Literature Review and Case Study. Glob. J. Health Sci. 2015; 8(3): 72-79. doi: 10.5539/gjhs.v8n3p72

Лабораторная работа 5/2

оформление результатов

Выполняется внеаудиторно. Загружается дистанционно для оценки преподавателем с использованием выбранного формата интерактивного общения (LMS, облачное файлохранилище, социальные сети, онлайн-сервисы организации совместной работы и т.д.).

5/2 - описательное

В свободной форме, отражающей:

цель эксперимента,
протоколы выполнения работы,
пошаговые иллюстрации приготовления самодельных растворов для окрашивания по Граму;
пошаговые иллюстрации окрашивания по Граму с использованием коммерческого набора и самодельных растворов;
сравнение результатов окрашивания одного и того же препарата различными способами;
общий вывод с указанием, достигнута ли цель эксперимента.

В качестве иллюстративного материала можно использовать фото- или видеофайлы

лабораторные протоколы

5/2 - Окрашивание микроорганизмов по Граму (сравнительный анализ)

Протокол выполнения опыта

Приготовление раствора бриллиантового зеленого

10 мл аптечного 1% спиртового раствора бриллиантового зеленого смешать с 10 мл воды.

Приготовление раствора Люголя для микроскопии

20 мл аптечного раствора Люголя смешать с 83 мл воды.

Приготовление йодного спирта

К 98 мл этанола добавить 2 мл 5% аптечной настойки йода и 0,46 г йодида калия; тщательно размешать.

Приготовление раствора вторичного красителя

Приготовить 10 мл водного раствора тартразина (2%, пищевой краситель), сафранина (0,25%, текстильный краситель) или кармуазина (0,25%, пищевой краситель).

Обязательные компоненты протокола

Осаждение клеток из культуры с использованием одной из самодельных центрифуг, протестированных в работе 2/2.
Разрушение клеток в присутствии детергента.

Окрашивание по Граму с использованием коммерческого набора реактивов

Провести окрашивание мазка суспензии бактерий в соответствии с инструкцией по применению набора реактивов для окрашивания по Граму (протокол может отличаться в зависимости от производителя наборов).

Окрашивание по Граму с использованием самостоятельно приготовленных реактивов (2 варианта в зависимости от способа обесцвечивания)

Приготовить мазки суспензии бактерий на двух предметных стеклах, для чего равномерно распределить суспензию на выбранных участках стекол и высушить;
Зафиксировать высушенные мазки термическим способом, для чего предметное стекло взять пинцетом и плавным движением провесть трижды над верхней части пламени горелки или спиртовки (время нагревания не должно превышать 2-3 с);
Нанести на мазки раствор бриллиантового зеленого на 1 мин;
Смыть краситель со стекол проточной водой;
Нанести на мазки раствор Люголя на 1 мин;
Смыть раствор Люголя водой;
Нанести на один мазок этанол на 30-60 с, на другой - йодный спирт на 1 мин;
Смыть обесцвечивающие растворы водой;
Нанести на мазки раствор вторичного красителя на 1 мин;
Смыть краситель и микроскопировать мазки.

организация работы

Подготовительная часть (преподаватель + лаборант): подготовка необходимых материалов и оборудования.

Подготовительная часть (лаборант): выращивание культур грамположительных (например, Bacillus subtilis, Lactobacillus sp., Streptococcus thermophilus, Lactococcus sp.) и грамотрицательных (например, Escherichia coli) бактерий; приготовление смешанной суспензии грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Основная часть (студенты на занятии): работа ведется в парах, полученная у преподавателя суспензия бактерий окрашивается реагенами из коммерческого набора и самостоятельно приготовленными реагентами.

результаты обучения

вопросы для обсуждения

Какие общие свойства у первичных красителей для окраски по Граму?
Зачем используется дополнительный краситель в окраске по Граму?
Можно ли найти общие свойства у вторичных красителей для окраски по Граму?

развиваемые навыки

адаптировать существующие лабораторные протоколы к использованием других реагентов и материалов
разрабатывать новые лабораторные протоколы
оценивать эффективность выделения целевого продукта из биологического материала

Идентификация бактерий

окраска по Граму

удалить

позволяет дифференцировать

грамотрицательные бактерии

многие вещества (как высоко-, так и низкомолекулярные) могут либо разрушать ДНК (нуклеазы), либо связывать её, либо мешать её определению (например, РНК и низкомолекулярные нуклеотиды при фотометрическом анализе или ингибиторы амплификации при ПЦР-анализе)

грамположительные бактерии

2019, Валерий Зайцев. Это произведение доступно по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial («Атрибуция — Некоммерческое использование») 4.0 Всемирная